异种牙本质修复兔颅骨缺损的实验研究

叶岚　王银龙　陈玉成　袁红春　殷保藏　徐建光

[摘要]目的：观察异种牙本质修复兔颅骨骨缺损的疗效，探索其作为骨移植替代材料的有效性。方法：将因正畸原因拔除的人健康前磨牙，制成直径2～3mm的牙本质块。在1%氯己定中浸泡5min。使用12只雄性健康新西兰大白兔，在颅骨各建立4个临界骨缺损，将自体骨、人牙本质随机填入骨缺损区，术后4、8、12周随机处死4只兔子，取出颅骨，通过大体观察、Micro-CT及组织学观察颅骨缺损修复情况，使用Micro-CT分析每个时间点新骨形成面积占骨缺损总面积百分比。结果：所有实验动物伤口愈合良好，未见明显炎症反应。经影像学评估，自体骨比异种牙本质成骨量相似，且差异无统计学意义（P>0.05）。组织学染色示：围绕在移植材料周围，可见新骨形成。结论：异种牙本质能促进和加速骨缺损的修复，有望为促进骨缺损的修复提供一种新思路。

[关键词]异种牙本质;骨缺损;兔颅骨缺损模型;新生骨;自体骨移植;Micro-CT

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）02-0082-03

Abstract： Objective  To investigate the effect of repairing skull defect with heterogeneous dentin in rabbits and the possibility as bone graft substitutes. Methods  Dentin blocks were prepared from human premolars that were extracted for orthodontic reasons. Dentin was processed into finer chips 2-3mm in diameter. The processed dentin was cleaned by socking them in 1% chlorhexidine for 5minutes.Bony defects were created on the heads of 12 male healthy NewZealand White rabbits. Four bony defects were created in each skull and randomly grafted with either human dentin blocks（experimental group） or autogenous bone grafts（control group）.Rabbits were sacrificed at 4、8 and 12 weeks. The general condition of rabbit was observed after operation， and bone defect repair was evaluated by Micro-CT at 4， 8 and 12 weeks. Then the tissue of defect area was harvested for histological staining to observe defect repair. Results  All animals survived to the end of experiment， and no incision infection occurred during repair process. Micro-CT demonstrated that the new bone volume were similar in the experimental group and the control group， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The observation of histology staining indicated that the surface of the grafted materials were covered with new bone. Conclusion  Heterogeneous dentin accelerated bone regeneration and augmentation. These resultes suggested that heterogeneous dentin provided potential as a bone graft resource during the bone healing process.

Key words： heterogeneous dentin; bone defect; rabbit skull defect model; new bone; autogenous bone transplantation; Micro-CT

因機械外伤、肿瘤切除、感染、生理性吸收、先天性畸形等因素造成颌骨缺损骨量不足在临床上很常见，成为制约种植技术发展和种植成功的重要原因[1]。因此如何增加骨缺损区的骨量是扩大种植牙适应证的关键因素。自体骨材料因其来源于自体，无免疫原性，植入后与宿主组织无免疫排异反应，而且具备骨移植材料的三大特性，包括骨生成性，骨传导性和骨诱导性[2]，中等至严重的颌骨缺损自体骨移植技术被认为是可靠的和可预测的，因此认为自体骨是骨移植材料的金标准[3]。虽然自体骨移植有很多优点，但诸如患者不接受在第二术区（髂嵴，颏部）取骨所带来的额外手术创伤、疼痛、出血及感染等;且受供区限制，取骨量少等缺点限制了自体骨的临床应用[4]。因此，研究骨缺损修复材料具有重要意义。牙本质其物质组成及理化特性与骨组织相似[5-6]，使用牙本质修复兔颅骨骨缺损，以观察其对骨缺损的修复能力。

1  材料和方法

1.1 材料：3月龄，雄性健康新西兰大白兔12只，体重约2.5kg;1%氯己定;瑞士Bio-Gide可吸收生物膜;因正畸原因拔除的人健康前磨牙若干（安徽医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊部提供）;高速手机;金刚砂车针;Micro-CT（SkyScan 1176，SkyScan，比利时）。

1.2 动物实验

1.2.1 兔颅骨骨缺损模型的建立：将12只雄性健康新西兰大白兔用3%戊巴比妥钠按1.0ml/kg进行静脉注射，麻醉后固定于手术台，备皮，消毒。在颅底、两耳之间向后作约5cm的切口，切开皮肤，皮下组织，肌层及骨膜，暴露颅骨，用球钻在颅骨区制备4个直径8mm的骨缺损（见图1），同时用生理盐水冲洗降温。

1.2.2 移植材料制备：将收集到的临床上因正畸原因拔出的人前磨牙，用高速涡轮机及金刚砂车针磨除牙釉质及牙骨质，去除髓腔内牙髓。用高速涡轮机等器械将其粉碎成直径为2～3mm大小的颗粒，经1%氯已定溶液浸泡5min后，生理盐水冲洗，分装后备用。术中将取出的兔颅骨骨质磨成2～3mm的骨块。

1.2.3 移植材料植入手术：快速将自体骨（对照组）、人牙本质块（实验组）各约1.5g随机放入骨缺损区，覆盖Bio-Gide膜，创口分层严密缝合。

1.2.4 术后处理：术后3d内每天肌肉注射40万U青霉素预防感染。分别于术后4、8、12周行灌注处死4只大白兔，取出实验样本，置于10%中性福尔马林固定液中固定。

1.3 观察指标

1.3.1 大体形态观察：术后密切观察兔子的饮食、活动情况，伤口有无红肿、溢脓。

1.3.2 放射学检查：采用Micro-CT观察新骨形成，将所有实验样本使用Micro-CT（SkyScan 1176）扫描，数据用Nrecon软件重建，得到各个断层的二维图像。将重建后的数据导入CT analyser软件，在每一截面选取目标区域，在目标区域内赋予新生骨合适的阈值，计算新生骨占骨缺损区的体积百分比，并创建3D模型，在CT vol中打开显示三维效果。

1.3.3 组织学观察：组织学标本经过常规固定、脱钙、石蜡包埋，制作成5μm厚的组织学切片，进行HE染色分析。观察缺损区修复情况。

1.4 统计学分析：采用SPSS 22.0软件对所有数据进行处理，采用t检验，P<0.05时差异有统计学意义。

2  结果

2.1 大体形态观察：术后1d所有兔子精神、饮食较差，无畏寒、发热征象，手术伤口无红肿、渗血现象。术后2～3d兔子精神、饮食、活动情况好转，1周后恢复正常。所有兔子术后无感染、无动物死亡。术区大体观察见图2。

2.2 放射學检查：Micro-CT结果表明：对照组与实验组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。且随着时间延长，新骨生成量增加。BV/TV比值（%）及统计学差异见表1。见图3。

2.3 组织学观察：组织学切片HE染色后，实验组及对照组可见新骨形成，成骨细胞、纤维结缔组织及新生骨组织围绕移植材料分布。术后4周，移植物周围可见少量炎细胞，少量新生骨形成;术后8周，围绕移植材料周围，成骨细胞增多，新生骨面积增大;术后12周，移植材料周围可见大量新生骨组织，排列逐渐变得规则。实验组染色结果见图4。

3  讨论

目前，组织工程学中应用牙本质主要有以下四种形式[7]：①提取牙本质中的非胶原蛋白;②使用脱矿牙本质;③去除牙本质中的有机成分;④使用未改性牙本质如：冻干牙本质、液氮冷冻牙本质。有研究表明：牙本质脱矿增加了其在组织工程学应用中的优势[8]。牙本质脱矿有利于生长因子及蛋白质释放从而有利于骨诱导性[9]。但1998年有报道显示部分脱矿牙本质颗粒未见骨诱导性[10]。在脱矿过程中最重要的是防止蛋白质变性。有研究表明，去除牙本质有机成分形成的变性牙本质会降低自身的机械强度[11]，使其不能很好的应用于承受应力的骨组织区。因此，未脱矿及变性的牙本质应用也是非常重要的。

在动物实验及临床试验中，均有将牙本质植入牙槽嵴缺损区，后在缺损区行种植的报道。如：Frank Schwarz教授利用自体牙根部牙本质作为骨增量材料，在8只猎狐犬上进行实验，12周后，埋入种植体，结果显示牙槽嵴增量高度、种植体与骨结合率良好[12]。对1名32岁女性患者，使用拔除的牙根制成牙本质后，行牙槽嵴骨增量手术，24周后进行种植。结果显示了良好的骨生成以及种植体的稳定[13]。

本实验采用人牙本质移植至兔颅骨。牙本质周围未见明显炎症反应，说明牙本质的免疫原性反应不是主要因素。牙齿的免疫原性与软组织、牙周韧带和牙髓有关，在本实验中，牙本质被用于移植前，牙髓等软组织均被去除。研究中没有发现明显异种移植的免疫原性反应，这也为牙本质的异体和异种移植成功开辟了可能[14]。牙本质可以从因正畸原因拔除的第三磨牙或前磨牙或其他途径中获得。

牙本质内具有骨诱导性，在植入骨缺损中能够融合并逐渐被骨取代，很可能是因为牙本质中含有骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）[15]。目前，对BMP的临床应用是一个热点，问题是为BMP寻找一个载体，可使BMP缓慢释放，且载体本身不应引起任何炎症反应[16]。

综上，本实验采用异种牙本质修复兔颅骨骨缺损，经体内观察，发现其生物相容性良好，验证了其具有促进骨缺损修复的能力，有望为促进骨缺损修复提供新的思路。对于如何处理牙本质以增加其骨诱导性及骨传导性，还需要更进一步的研究。

[参考文献]

[1]李德超，王心彧.基于牵张成骨骨增量的种植前外科探讨[J].口腔医学研究，2019，35（4）：313-315.

[2]Kabir MA，Murata M，Akazawa T，et al.Evaluation of perforated demineralized dentin scaffold on bone regeneration in critical‐size sheep iliac defects[J].Clin Oral Implants Res，2017，28（11）：e227-e235.

[3]Gultekin BA，Bedelogiu E，Kose TE，et al.Comparison of bone resorption rates after intraoral block bone and guided bone regeneration augmentation for the reconstruction of horizontally deficient maxillary alveolar ridges[J].Biomed Res Int，2016，2016：1-9.

[4]Aylin Dogan，Bahattin Alper Gultekin，Serdar Yalcin，et al.The use of autogenous particulate dentin graft materials at insufficient bone areas-case series[J].Clin Oral Implants Res，2018，29：443.

[5]Morales Hilde.New solutions for bone regeneration-autologous tooth dentin graft： an histological study in humans[J].Clin Oral Implants Res，2018，29：285.

[6]Peng Li，HuiCong Zhu，DaHong Huang.Autogenous DDM versus Bio-Oss granules in GBR for immediate implantation in periodontal postextraction sites： a prospective clinical study[J].Clin Implant Dent Relat Res，2018，20（6）：923-928.

[7]Tabatabaei FS，Tatari S，Samadi R，et al.Different methods of dentin processing for application in bone tissue engineering：A systematic review[J].J Biomed Mater Res Part A，2016，104（10）：2616-2627.

[8]Mordenfeld Arne，Hallman Mats，Lindskog Sven.Tissue reactions to subperiosteal onlays of demineralized xenogenous dentin blocks in rats[J].Dent Traumatol，2011，27（6）：446-451.

[9]熊航，谢志刚，鲍济波.脱矿牙本质基质的基本性能及制备[J].国际口腔医学杂志，2016，43（1）：90-94.

[10]Ike M，Urist MR.Recycled dentin root matrix for a carrier of recombinant human bone morphogenetic protein[J].J Oral Implantol，1998，24：124-132.

[11]Tsuchiya H，Wan SL，Sakayama K，et al.Reconstruction using an autograft containing tumour treated by liquid nitrogen[J].J Bone Joint Surg Br，2005，87（2）：218-225.

[12]Schwarz F，Golubovic V，Becker K，et al.Extracted tooth roots used for lateral alveolar ridge augmentation： a proof-of-concept study[J].J Clin Periodontol，2016，43（4）：345-353.

[13]Schwarz F，Schmucker A，Becker J.Initial case report of an extracted tooth root used for lateral alveolar ridge augmentation[J].J Clin Periodontol，2016，43（11）：985-989.

[14]Yu-Chih Huang，Wei-Zhen Lew，Sheng-Wei Feng，et al.Histomorphometric and transcriptome evaluation of early healing bone treated with a novel human particulate dentin powder[J].Biomed Mater，2017，12（1）：1-12.

[15]Kamal M，Andersson L，Al-Asfour A，et al.Bone regeneration in rabbit calvarial critical-sized defects filled with composite in situ formed xenogenic dentin and biphasic tricalcium phosphate/hyroxyapatite mixture[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2019，107（3）：773-782.

[16]In-Woong Um，Sang-Ho Jun，Pil-Young Yun，et al.Histological comparison of autogenous and allogenic demineralized dentin matrix loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 for alveolar bone repair： a preliminary report[J].J Hard Tissue Biol，2017，26（4）：417-424.

[收稿日期]2019-07-31

本文引用格式：葉岚，王银龙，陈玉成，等.异种牙本质修复兔颅骨缺损的实验研究[J].中国美容医学，2020，29（2）：82-84.