我国部分地方蛋鸭品种鉴定

王统苗，张 莘，刘本帅，陈博雯，常国斌，白 皓，江 勇，张 扬，王志秀，陈国宏*

（1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.扬州大学 农业科技发展研究院/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009）

【研究意义】微卫星（Microsatellite）也称简单重复序列，是一种短串联重复序列，包括核心序列和侧翼序列，核心序列重复数是2～7 bp，重复数的不同就形成了微卫星高度的多态性，微卫星标记因其多态性高、共显性遗传且易于检测，现已经大量应用于品种品系的鉴定[1]。我国是世界上鸭品种资源分布最为丰富的国家，但是因为大量引入外来品种，许多地方品种与其杂交，纯种不断减少，我国地方鸭品种资源的保种亟需改善。为了解引进品种的遗传特征，更有效地保证纯种鸭的资源，有必要对引进品种进行遗传学分析，而微卫星标记已成为遗传多样性常用的方法[2]。与其他形态学和生化标记相比，微卫星分子标记能够直接反映DNA水平上的变化，它的遗传不受环境和基因表达的限制，是动物品种鉴别的理想选择[3]。【前人研究进展】陈赢男等[4]利用10对微卫星引物鉴别油茶品种；李智军等[5]对5对微卫星位点多态性进行分析，并通过对有效等位基因数的差异显著性分析辅以各品种特有基因型可以初步鉴别3个马匹品种；韩宏晓等[6]利用65个微卫星位点主要包括的15个基因座位基于贝叶斯方法、位点频率法和遗传距离法等遗传分析方法进行个体归类准确性分析，发现筛选出的微卫星位点可用于纯种犬的品种鉴定，完成了对常见宠物犬品种鉴定的初步应用研究；李显耀[7]从20个微卫星标记中筛选出7个标记可以达到鉴定H蛋鸡配套系品系鉴定的目的；张丽娟等[8]利用10个微卫星标记，对引进国外的w-98白壳蛋鸡配套系的四个系进行了品系鉴定。【拟解决的关键问题】本研究对攸县麻鸭、三穗鸭、金定鸭、麻旺鸭、绍兴鸭、荆江麻鸭、山麻鸭等7个品种进行品种鉴定，主要因为这7个品种都属于蛋鸭品种，且均为麻鸭，仅仅用肉眼难以辨认出正确的品种，因此本文利用微卫星分子标记，实现对这7个鸭品种的初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 样本采集

7个鸭品种分别是三穗鸭、麻旺鸭、绍兴鸭（福建省石狮国家级水禽基因库）、荆江麻鸭、攸县麻鸭、山麻鸭、金定鸭（泰州国家级水禽基因库），每个品种各30只，公母各半。这些鸭品种采用家系保种法进行“家系等量随机选配”的继代繁育。每一世代的保种群规模70个家系（其中40个家系为保种核心群），每一家系饲养14♀，2♂，其中2♀1♂作为备用，下一世代留种时每家系保持12♀1♂。

1.2 样本量确定

本研究通过从70只麻旺鸭分别抽取10、20、30、40、50、60只样本量，每个样本量重复抽样10次，取其平均值，统计基因型频率，确定样本量。

1.3 鸭基因组DNA提取

于鸭翅静脉处采血，用传统酚-氯仿法提取基因组总DNA[9]，测DNA浓度和纯度，将浓度稀释到100 ng/L，保存在-20℃冰箱中。

1.4 微卫星位点

根据文献[10-11]提供的5对微卫星位点AJ515884、CMO11、AJ515898、AJ515893、AJ272579作为试验位点，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.5 PCR反应体系与产物扩增

PCR反应体系：TaqMaster Mix（Dye Plus）10 μL，超纯水7 μL，10 pmol/μL上下游引物各1 μL，100 ng/L DNA模板1.0 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，53～73℃退火30 s（因座位而异），72℃延伸30 s，共30～35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.6 STR分型测序

将PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司，利用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪进行STR分型测序。

1.7 统计分析

GeneMapper4.0软件生成独立的图谱文件并读出峰值的大小、片段长度的大小、峰面积的大小，同时判断纯合子（单峰）或杂合子（双峰）。利用Microsatellite-Toolkit软件计算等位基因频率、期望杂合度与观察杂合度，根据Botstein等[12]的公式计算每个品种的多态信息含量。利用Excel表格构建柱状图。

1.8 聚类方法

采用了UPGMA聚类方法，以奈氏遗传距离（DA）为依据，构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 样本采集量

从图1中可以看出，当样本量为10时，离散程度最大，变异最大；随着样本量的增大，离散程度不断减小。不同样本量抽样10次的平均基因型频率相近。

2.2 微卫星标记

5个微卫星标记最优化条件见表1。

2.3 STR分型测序图

基于ABI-3730XL型DNA测序平台对扩增产物进行扫描。部分位点的扩增分型效果见图2。

图1 基因型频率Fig.1 Genotype frequency

2.4 所选微卫星标记的遗传多样性

5对微卫星标记在个体层面上的遗传学参数见表2，5对引物在7个群体中共检测到62个等位基因，平均每个位点12.4个，其中有3个位点的等位基因数超过10个，其中CMO11位点检测到的等位基因数最多，为17个；AJ515898位点检测到的等位基因数最少，为8个，7个鸭品种各个微卫星基因座的有效等位基因数的变化范围为1.330～2.762，其中微卫星标记AJ515898的有效等位基因数最多，达2.762；最少的微卫星标记是AJ272579，只有1.330个。5个微卫星标记均为中高度多态位点，其中AJ515884、AJ515898标记为高度多态位点，其它3个标记为中度多态位点。

2.5 5个微卫星基因座在各品种中的多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）和群体杂合度（H）

从表3可以看出，麻旺鸭的多态信息含量最高，其次是荆江鸭、山麻鸭、绍兴鸭、攸县麻鸭、三穗鸭，而金定鸭最低；麻旺鸭的有效等位基因数最多，攸县麻鸭最少；麻旺鸭群体杂合度最大，攸县麻鸭群体杂合度最小。由此可知麻旺鸭的遗传变异最大。

表1 5对荧光引物的最优化反应条件Tab.1 The optimize reaction conditions of 5 pairs fluorescence primers

图2 金定鸭D07个体在AJ515884位点的STR分型结果Fig.2 STR genotyping result of AJ515884 locus of Jin Ding duck individual D07

表2 5对微卫星标记的遗传学参数Tab.2 Genetic parameters of 5 pairs of SSR primers

2.6 7个鸭品种的基因型频率

表4列出了7个鸭品种的基因型频率。

2.7 7个鸭品种间的聚类分析

从图3可以看出，这7个鸭品种总共分为三大类，金定鸭先与绍兴鸭聚为一类，再与荆江鸭聚为一类；山麻鸭与麻旺鸭聚为一类，攸县麻鸭与三穗鸭聚为一类。

2.8 鸭品种的初步鉴定

图4分别是攸县麻鸭、三穗鸭、金定鸭、麻旺鸭、绍兴鸭、荆江麻鸭、山麻鸭根据等位基因型频率作的柱状图，Y轴为基因型频率，从图中可以看出，7个鸭品种的柱状图完全不同，可以明显的区分这7个鸭品种。

表3 5个微卫星座位在各品种中的多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）和群体杂合度（H）Tab.3 Polymorphism information content，the number of effective alleles and heterozygosisty of 5 microsatellite loci in each breeds

表4 7个鸭品种的基因型频率Tab.4 Genotypic frequencies of 7 duck breeds

图3 基于Da遗传距离构建的7个群体的UPGMA聚类分析Fig.3 Phylogenetic tree of 7 duck breeds by UPGMA based on Da genetic distance

图4 鸭品种鉴定Fig.4 Identification of duck breeds

3 讨 论

3.1 样品采集

Mathur（1994）通过模拟2～10 000个个体的DNA指纹后指出在应用DNA指纹标记时，每个品种有15～20个个体就可获得遗传变异合理的估计值[13]。本研究通过计算不同样本量的基因型频率，发现样本量越多，基因型频率越能代表整个群体的基因型频率，本研究选取样本量为30进行试验，基本可以获得群体基因型频率的合理估计值。

3.2 遗传参数分析

有效等位基因数（Ne）、杂合度（He）和多态信息含量（PIC）都可用于估算群体内的遗传变异，其值的高低显示了群体内个体的遗传变异程度，其值越高，变异程度越大[14]。每个微卫星位点具有高多态性，能够准确地反映各品种内的遗传结构，对品种的鉴定结果有很强的说服力[15]。有效等位基因数（Ne）是反映不同群体间和群体内不同基因位点间遗传变异程度的一个指标[17]。实验5个微卫星标记，通过STR分型测序，7个鸭品种在5个微卫星位点中检测到等位基因数范围为8～17，且平均有效等位基因数为1.812，根据微卫星位点选择标准：每个微卫星标记等位基因数大于或等于4非常适合用于遗传多样性评估。试验所选取的5个微卫星标记，在7个鸭品种中均达到了中高度多态，因此上述选择的微卫星标记利于遗传多样性分析，为品种鉴定奠定基础。

3.3 聚类分析

遗传距离是体现各品种间遗传差异程度的重要指标。本研究基于Da遗传距离构建的系统发育树。从系统发育树来看，金定鸭、绍兴鸭和荆江鸭聚为一类，可能是因为金定鸭是福建地方鸭品种、绍兴鸭为浙江地方鸭品种，荆江鸭则因为这三个地方地理位置较近，过去可能发生过基因交流。山麻鸭与麻旺鸭聚为一类，攸县麻鸭与三穗鸭聚为一类。

3.4 品种鉴别

传统品种鉴定是根据动物的形态学、细胞学等特征来鉴定。分子标记是根据蛋白质、核酸分子的变异，检测遗传结构及其变异直接反映了DNA水平上遗传变异，这种标记数量很多，分布整个基因组，不受环境和基因表达的影响，分子标记常用于畜禽品种鉴定，而微卫星标记是分子标记的一种常用方法[3]。中国猪品种志中写到，遗传稳定性是品种必须具备的，所以品种鉴定必须基于基因型特征[17]。试验将这种方法，运用到攸县麻鸭、三穗鸭、金定鸭、麻旺鸭、绍兴鸭、荆江麻鸭、山麻鸭的鉴定中。选择的5个微卫星位点在7个鸭品种中都具有共有基因型，但是由于一些微卫星标记在不同品种间的等位基因频率具有明显差异，因此可以用这些标记对各品种区分。文中利用不同的基因型频率绘制的柱状图可以明显的看出这7个品种各不相同可以很好的鉴别这7个品种。