油茶“三华系列”花粉活力测定及花粉保存

陈 雅 ，袁德义 *，李 葵 ，杨颖慧 ，金亦佳 ，林铭浩 ，邹 锋

（1.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004；2.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙410004；3.湖南省怀化市林业科学研究所，湖南 怀化 418000）

【研究意义】油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶科（Theacea）山茶属（Camellia）植物，是我国木本油料树种中的主栽物种之一，分布于南方18个省（市、自治区）700多个县（市）[1]。茶油作为高级食用油，被誉为“东方橄榄油”[2]，长期食用茶油对心脑血管疾病具有良好的保健作用。“三华系列”是普通油茶大果高产新品种，分别为‘华硕’（C.oleifera‘Huashuo’）[3]、‘华鑫’（C.oleifera‘Huaxin’）[4]和‘华金’（C.oleifera‘Huajin’）[5]。油茶是自交不亲和和异花授粉的木本油料树种，为进一步充分利用“三华系列”优质种质资源及开展相关的杂交育种研究，如科学品种配置栽培和油茶的花粉直感效应研究等，开展“三华系列”系列杂交在充分利用优质资源上显得尤为重要。而花粉是种质传递遗传信息的重要形式之一，是种质资源保存及杂交育种的重要材料[6]。在油茶杂交育种工作时若遇花期不遇、花粉污染等问题，这给杂交育种等工作带来诸多不便。这些问题也恰好说明开展“三华系列”花粉活力测定及其保存等研究具有重要意义。【前人研究进展】用于检测花粉活力的方法有很多，主要包括离体萌发法、I2-KI法、FDA荧光染色法、氯化三苯基四氮唑染色法（TTC法）和稀硝酸测定法等[7-8]。其中，I2-KI法是通过花粉内的淀粉含量来指示花粉活力，以此反映花粉的代谢及营养情况[9]；FDA荧光染色法能测试花粉中酶活性及质膜的完整性[10]。花粉的离体萌发法是研究花粉生物学的一种非常方便和有效的技术[11-12]，是测定花粉活力最直观可靠的方法。花粉萌发能力是检测花粉生活力的指标之一[13]，通常以花粉萌发率来表示。袁德义等[14]以攸县油茶等7种材料进行试验，发现离体萌发法能够准确测定油茶花粉生活力。【本研究切入点】目前，用染色法来跟踪和快速测定油茶花粉活力少有报道，而染色法快速便捷，是开展授粉前快速测定花粉活力的首选方法，因此开展亲本花粉活力测定，选择适宜的花粉活力检测方法显得尤为重要。【拟解决的关键问题】本研究以油茶“三华系列”为试材，采用离体萌发法、I2-KI法和FDA荧光染色法观测其在不同贮藏条件（温度）下的花粉活力情况，以期筛选出最适宜的花粉活力检测方法，旨在为油茶花粉贮藏以及杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油茶栽培品种“三华系列”（‘华硕’、‘华金’、和‘华鑫’）栽种于湖南省长沙市中南林业科技大学油茶科研基地。在盛花期花蕾尚未展开时，选择健康的15年生油茶植株，收集花枝，带回中南林业科技大学经济林重点实验室。在花枝上取发育良好的花蕾进行水培。花蕾开放时，用镊子取出花药，放在硫酸纸中，在80 W灯泡下放置3～4 h[15]，保持温度在28～30℃，使花药开裂并散粉。收集花粉分成两部分，一部分花粉用于当天的活力测试，另一部分分装在含有不同硅胶干燥剂的10 mL的离心管中，用于不同温度条件下贮藏的花粉活力测试。

1.2 试验方法

采用离体萌发法[16]，FDA荧光染色法[17]和I2-KI法[18]测定油茶“三华系列”的新鲜花粉活力。“三华系列”的每种贮藏花粉各分成4份，每份6瓶，共24瓶，分别置于室温（Room temperature，RT）、冰箱冷藏室（4℃）、冰箱冷冻室（-30℃，-80℃）中。达到设定贮藏时间（1周、5周、9周、13周、17周和26周）时，从4种温度中取出“三华系列”花粉并利用离体萌发法[14]和FDA荧光染色法[10]来测定其花粉活力。对于放置在-30℃和-80℃贮藏温度下的花粉，需取出后逐步解冻，放入4℃下过渡1 h后再测定活力[19]。每个处理重复3次。

1.3 数据处理与分析

“三华系列”油茶花粉活力以平均值±标准差表示。利用SPSS软件19.0进行单因素方差分析（Oneway ANOVA）和T检验（P＜0.05，P＜0.01）。

2 结果与分析

常温条件下，‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’花粉活力在不同的测定方法中具有明显差异（表1）。采用I2-KI染色法测定“三华系列”新鲜花粉活力，花粉粒全被染成黄褐色（图1A），花粉无活力。用FDA荧光染色法和离体萌发法测定‘华鑫’、‘华硕’及‘华金’新鲜花粉活力，结果存在显著差异（P＜0.05）。采用FDA荧光染色法有活力的花粉发出黄绿色荧光，无荧光的花粉表示无活力（图1B）。用离体萌发法和FDA荧光染色法的检测结果表明3个品种的花粉活力具有显著差异，‘华鑫’花粉活力最高，分别为86.54%和93.02%；‘华硕’花粉活力较低，分别为77.96%和85.18%；而‘华金’花粉活力最低，分别为47.57%和74.81%，说明这2种方法检测结果存在显著差异。2种检测方法得出的花粉活力结果有显著差异（P＜0.05），FDA荧光染色法检测的结果显著大于离体萌发法的检测结果（表2，图2）。

表1 3种测定方法测定的新鲜花粉活力比较Tab.1 Comparison of the vitality of fresh pollen measured by 3 methods of investigation

图1 不同花粉活力测定方法的检测Fig.1 Detection of different test methods in pollen viability

图2 两种方法检测贮藏的“三华系列”油茶花粉活力情况Fig.2 Comparison of two staining methods for pollen viability of Camellia oleifera under different four temperatrue

在不同贮藏时间下，‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’适宜的贮藏温度大体呈现出一致的规律，基本无显著差异。短期贮藏（5周）下，“三华系列”花粉适宜于在4℃低温贮藏，花粉活力40%～70%，花粉活力显著高于其他贮藏温度的花粉；长期贮藏（26周）下，-80℃贮藏条件下贮藏效果优于-30℃，在26周时花粉萌发率近似为-30℃的2倍，花粉活力30%～40%。

室温贮藏下，随着时间的推移，花粉活力下降速度逐步加快（图2，表2）。室温贮藏1周后，离体萌发法显示‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’分别下降了27.86%和10.79%和8.92%，而FDA荧光染色法分别下降了23.28%、13.63%和3.01%；贮藏5周后，离体萌发法检测‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’花粉萌发率下降幅度大约都在13%左右，FDA荧光染色法则分别下降了20.46%、8.3%和15.31%，表2还可以看出‘华硕’前9周花粉活力较其它两种花粉下降相对较快。贮藏9周后，‘华硕’花粉活力下降了19.73%（离体萌发法）和21.59%（FDA荧光染色法）；‘华金’花粉活力下降了30.51%（离体萌发法）和41.24%（FDA荧光染色法）；‘华鑫’花粉活力下降了47.16%（离体萌发法）和42.93%（FDA荧光染色法），说明在贮藏9周后‘华金’和‘华鑫’的花粉活力较‘华硕’下降得快。贮藏至13周，油茶“三华系列”花粉皆失去活力。

表2 比较FDA荧光染色法与离体培养法在不同贮藏温度及贮藏时间下油茶“三华系列”花粉活力情况Tab.2 Comparison of FDA test and in vitro germination under different storage temperature and storage time the pollen viability of three Camellia cultivars

在4℃冷藏条件下，经FDA荧光染色法和离体萌发法检测发现在“三华系列”中花粉活力随着贮藏时间延长而明显下降（P＜0.05），且贮藏时间与室温贮藏相比“三华系列”明显延长（图2，表2）。贮藏1周后，‘华硕’花粉活力下降了2.24%（离体萌发法）和0.98%（FDA荧光染色法）；‘华金’花粉活力增加了4.54%（离体萌发法）和2.30%（FDA荧光染色法）；‘华鑫’花粉贮藏1周后活力下降了3.61%（离体萌发法），而经FDA荧光染色法检测后发现其活力没有下降的趋势，增加了0.39%。同时发现，‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’花粉活力在-30℃和-80℃储藏条件下显著高于5周前的花粉活力（P＜0.05）（图2，表2）。‘华金’花粉贮藏至13周时，花粉活力分别为10.95%（离体萌发法）和25.32%（FDA荧光染色法），过了4周后，花粉活力为0（离体萌发法）和8.65%（FDA荧光染色法）。花粉贮藏至26周时，‘华鑫’花粉和‘华硕’花粉均丧失活力，但‘华硕’花粉丧失活力的趋势较‘华鑫’缓慢。

在-30℃储藏条件下，采用FDA荧光染色法和离体萌发法测定发现‘华硕’、‘华金’和‘华鑫’在5周后花粉活力显著高于4℃冷藏条件下的花粉（P＜0.05）（图2，表2）。贮藏1周后，与新鲜花粉相比，‘华金’花粉生活力有短期内升高的趋势，花粉活力增加了6.3%（离体萌发法）和0.77%（FDA荧光染色法）。‘华硕’和‘华鑫’花粉无此现象。贮藏至26周，‘华硕’，‘华金’的花粉活力分别保持在17%左右（离体萌发法）和22%左右（离体萌发法）；‘华鑫’的花粉活力维持在36.42%（离体萌发法）和44.08%（FDA荧光染色法）。

在-80℃储藏条件下，与其他贮藏温度条件比较，“三华系列”的花粉活力下降幅度最小，总体呈缓慢下降的趋势（图2，表2）。贮藏1周后，与新鲜花粉相比，“三华系列”花粉生活力皆有短期内升高的趋势；贮藏至5周后，‘华硕’花粉经离体培养法和FDA荧光染色法检测发现花粉活力值有显著差别，离体培养法发现‘华硕’花粉在贮藏5周后，其花粉活力显著下降，而FDA荧光染色法测定的结果与第一周没有显著区别，而‘华金’与‘华鑫’花粉在贮藏5周后，两种不同染色方法发现其活力显著下降；花粉贮藏至26周后，‘华鑫’花粉活力为50.18%（离体萌发法）和64.16%（FDA荧光法）；‘华硕’花粉活力为34.86%（离体萌发法）和44.06%（FDA荧光染色法）；‘华金’花粉活力为26.94%（离体萌发法）和27.64%（FDA荧光染色法）。

通过对FDA荧光染色法与离体培养法2种花粉活力检测方法进行相关性分析，发现FDA荧光染色法在4种不同贮藏温度下的测定结果与离体培养法表现为极显著强相关，相关系数大于0.9（表3），这表明FDA荧光染色法可跟踪测定“三华系列”花粉活力，是开展授粉工作前快速检测花粉活力的好方法。

表3 4种贮藏温度下3个油茶品种的FDA荧光染色法与离体萌发法的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of FDA test and in vitro germination of three Camellia cultivars under 4 storage temperature

3 结论与讨论

本研究中，通过比较油茶的“三华系列”花粉在不同贮藏温度下活力，可看出“三华系列”不同品种在贮藏时间上存在较大差异，‘华鑫’花粉的耐贮性高于‘华金’和‘华硕’。这表明花粉生活力的高低主要取决于种（品种）自身的遗传特性[8]。因此，在杂交育种中，尤其是隔年的杂交育种计划中，应该选择‘华鑫’作为父本，这在一定程度上能提高油茶杂交育种中的授粉成功率，是获得杂交后代及创新种质的基础。

影响花粉寿命的因素，除受遗传因素外，环境因素对花粉贮藏的效果也会产生影响。明确贮藏花粉的环境因素对其活力的影响是利用贮藏花粉进行杂交育种试验的前提[20]。其中，温度是影响花粉活力的主要因素[21]。本研究中，贮藏温度影响花粉活力下降的速度。在4种不同贮藏温度下，花粉活力随贮藏时间的延长而下降。室温条件下花粉活力下降得最快，贮藏时间最短。据前人研究发现，在室温条件下，油茶花粉寿命的长度一般不超过2周[22-23]。而本研究中采用80 W灯泡下使花粉散粉这一花粉收集和处理方式，使其在室温贮藏下13周后花粉才丧失活力。说明相较于在硅胶干燥器中干燥油茶花粉散粉，采用80 W灯泡下使花药散粉有利于保持其活力。同时本研究发现4℃低温冷藏条件下适合油茶“三华系列”花粉的短期贮藏，5周前花粉活力高于-30℃和-80℃贮藏温度下的花粉，可能是由于一些花粉粒在这两种低温条件下细胞组织结构易结冰造成损伤，从而导致其花粉活力下降。-80℃低温冷冻贮藏适宜于油茶花粉的长期贮藏，与张鹏等[24]和李广清等[25]的研究结果一致，低温有利于油茶花粉长期贮藏可用于隔年育种。本研究中也同样发现“三华系列”中‘华金’在4℃、-30℃和-80℃贮藏条件下和‘华硕’在-80℃贮藏条件下出现花粉活力短期升高的现象[26]，这可能是‘华金’和‘华硕’花粉可能存在生理后熟现象，在矮牡丹[27]、厚荚相思[28]等植物均发现过这种现象，这可能是刚刚采集回来的新鲜花粉没有完全生理成熟，低温贮藏花粉可进一步实现油茶花粉的生理成熟，这有待进一步深入研究。

不同植物花粉内含物成分不同，适用的染色剂可能不相同。I2-KI法是通过花粉内的淀粉含量来指示花粉活力[9]，可在一定程度上反映花粉的代谢及营养情况。据前人报道，魏冬梅等[29]观察到油茶花粉成熟时，花药内积累了大量的脂滴和少量的淀粉多糖内含物，说明油茶属于脂质型花粉而不属于淀粉型花粉，此研究结果能在一定程度解析本研究观察到的现象，即采用I2-KI染液将“三华系列”花粉粒皆染成黄褐色。这说明I2-KI染色效果较差，不适宜作为油茶花粉活力检测方法。而这与赵鸿杰等[18]对张氏红山茶、越南抱茎和南山茶研究相悖，这有待进一步验证。与此同时，离体萌发法和FDA荧光染色法检测的花粉活力结果有显著差异（P＜0.05），FDA荧光染色法检测的花粉活力显著高于离体萌发法检测的花粉活力，这说明FDA荧光染色方法在测定油茶花粉活力时可能存在高估的情况，与Shivanna等[10]研究8个属（黑麦属、鸢尾属、苔属、荸荠属、毛地黄属等等）和周坚等[17]研究鹅掌楸属的结论一致。经相关性分析发现，这2种检测方法存在极显著强相关关系，FDA荧光染色法可作为跟踪和快速测定油茶花粉生活力变化的方法，该方法可能表征油茶花粉潜在的活力。

花粉的合理贮藏和花粉活力的鉴定可以保证人工授粉杂交育种中获得大量的杂交后代，这在一定程度可以提高杂交育种的成功率和质量[30]。因此，建议当采用贮藏花粉进行人工控制授粉时，应根据所检测的花粉活力情况来开展授粉工作。本研究中无论是新鲜花粉还是贮藏花粉，FDA荧光染色法均可作为跟踪和测定油茶花粉活力变化的方法来表征油茶花粉潜在活力，是开展授粉工作前快速检测花粉活力的好方法。-80℃是油茶最适合的长期（26周）贮藏花粉温度，4℃贮藏下是花粉短期（5周）保存最适宜的条件。其中，贮藏的花粉对杂种子代的后期生长状况的影响还有待进一步研究。