补阳还五汤抑制TLR4信号通路减轻db/db糖尿病小鼠周围神经病变炎症反应

暴 鹏,李 雪,孙丽莎,张晓冉,杨欣怡,李朝敏

(成都中医药大学附属医院内分泌科,成都 610075;*通讯作者,E-mail:Chenyi80066545@163.com)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病患者主要并发症之一,主要临床表现为触诱疼痛、四肢异常性疼痛、痛觉过敏等感觉和自主神经症状[1]。糖尿病患者中发病时间超过10年的,DPN发病率高达90%,致残率极高,严重降低患者生活质量[2]。补阳还五汤(Buyang Huanwu decoction,BYHWD)为中医临床使用的经典方剂,源自《医林改错》的经典方剂,由生黄芪、当归、桃仁、赤芍、川芎、地龙,红花七味药组方而成,具有益气养血、活血通络之功效,其有效成分主要是芍药苷、黄芪甲苷等[3]。BYHWD的主要药理作用包括:改善个体微循环作用、改善血液流变学作用、抗氧化作用,抗炎作用,调节机体免疫以及保护神经作用等[4],对DPN疗效显著。DPN患者通常伴有炎症症状,而BYHWD对DPN炎症反应的作用机制尚不明确。因此,本研究采用db/db小鼠(为一种自发性2型糖尿病的小鼠模型)作为DPN炎症反应模型,观察补阳还五汤对db/db小鼠TLR4/MAPK/NF-κB信号通路以及炎症因子的影响,探讨BYHWD通过TLR4/MAPK/NF-κB信号转导轴对db/db小鼠周围神经炎症损伤的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

同周龄同系别的7周龄SPF级雄性db/db小鼠40只,体质量25-35 g,7周龄SPF级雄性db/m小鼠,10只,体质量20-25 g,均购于南方医科大学动物实验中心,许可证号:SCXK(粤)2017-0045。实验环境,室温控制在20-25 ℃,相对湿度控制在55%-65%,自由进食,摄水,饮用水为无菌去离子水,12 h光照昼夜循环。

1.2 药物

补阳还五汤各组方药材颗粒均购自成都中医药大学附属医院,包括黄芪生黄芪120.0 g、当归6.0 g、赤芍4.5 g、川芎4.5 g、桃仁3.0 g、红花3.0 g、地龙3.0 g组成。

1.3 主要试剂和仪器

兔抗TLR4多克隆抗体兔抗、兔抗p38 MAPK和p-P38 MAPK购自美国Abcam公司,兔抗IκB-α和p-IκB-α多克隆抗体兔抗、兔抗P65和p-P65多克隆抗体购自美国CST公司。IL-6、IL-1β和TNF-α细胞因子检测试剂盒均购自江苏酶免生物工程有限公司。化学发光仪(上海天能科技有限公司);凝胶电泳仪(美国BIORAD公司);Maroche ATOM全自动酶联免疫分析系统(意大利Maroche公司);RB200型智能热板仪(成都泰盟软件有限公司)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);二氨基联苯胺(DAB)显色液(美国Hyclone公司);ECL超敏发光试剂盒(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)。

1.4 BYHWD的制备

补阳还五汤每剂的总质量为144.0 g(即黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁药材颗粒各1袋,与该方处方组成一致),溶解于温水(30-40 ℃,下同)11.3 ml中,配制成质量浓度约为12.8 g/ml(以颗粒剂总质量计)的药液,再用温水分别稀释成6.4,3.2,1.6 g/ml的药液,备用。

1.5 动物分组及给药

将40只db/db小鼠置于SPF级动物房进行适应性饲养1周,按照空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L标准,确认小鼠为糖尿病模型,按照小鼠的FBG和体质量数据,进行分层,随机分组分为4组:模型和BYHWD高、中、低剂量(6.4,3.2和1.6 g/kg)组,小鼠的给药剂量,根据小鼠与人体表面积换算法计算,另将10只db/m小鼠(为表型正常的小鼠)作为空白对照组。给药组按体质量每千克予10 ml相应浓度的药物溶液灌胃,空白对照和模型组按体质量每千克予10 ml的去离子水灌胃给药,每天灌胃给药1次,持续给药84 d。

1.6 足底热敏反应时长实验

第84天末次给药后,开启智能热板仪,将热敏板温度设置为55 ℃,待温度稳定在55 ℃后,将小鼠放于热敏板上,同时开始计时,直至小鼠开始出现舔舐后足反应的时间作为作为该小鼠的足底热敏反应时间。对每只小鼠均重复实验3次,每次间隔15 min,计算3次的平均值。

1.7 血清IL-6、IL-1β和TNF-α的含量测定

第84天末次给药后,水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,常温静置1 h后,离心,分离血清,采用ELISA试剂盒(出产厂商)检测血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量,严格按照试剂盒中的说明书进行实验操作。

1.8 Western blot测定测背根神经节中TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的表达

根据报道的方法[5],快速取出小鼠背根神经节,称量,根据凯基全蛋白提取试剂盒说明书,提取神经节总蛋白,BCA定量,加入蛋白上样缓冲液中,沸水变性,各组同一上样量于SDS-PAGE中进行恒流电泳,恒压湿电转移到PVDF膜(0.22 μm);加入预先配置的封闭液(5%胎牛血清),室温摇床封闭1 h;孵育一抗:加入TLR4、p-P38、p-IκB-α、p-P65、GAPDH一抗,4 ℃冷室摇床孵育过夜。TBST洗膜,再加入对应一抗种属的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,室温孵育1.5 h。按照ECL发光液说明书1 ∶1配比进行显影;化学发光仪对条带进行扫描,Image J软件分析各条带中目的蛋白的密度值,以目的蛋白(TLR4,p-P38,p-IκB-α,p-P65蛋白)与内参(GAPDH)的比值进行统计和分析。

1.9 统计学分析

所用数据均以平均数±标准差表示,利用SPSS 19.0统计软件对所得数据进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间的多重比较采用LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠足底热敏反应时间的变化

结果显示,模型组小鼠足底热敏反应时间较空白对照组显著增加(P<0.05);与模型组相比,补阳还五汤各剂量组足底热敏反应时间缩短,差异有统计学意义(F=56.48,P<0.05,见表1)。在给药组中,随着剂量的增加,db/db小鼠热敏反应时间相应降低,以高剂量组db/db小鼠热敏反应时间减少较为显著,约为模型组的2倍。

表1 各组小鼠足底热敏反应时间比较

Table 1 Comparison of plantar thermal response time of mice among five groups

组别n足底热敏反应时间(s)空白对照组1010.94±1.02模型组1023.53±1.62#补阳还五汤低剂量组1019.38±0.91#∗补阳还五汤中剂量组1015.01±0.76#∗补阳还五汤高剂量组1013.37±0.85∗

与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

2.2 小鼠血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平的变化

与空白对照组比较,模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,BYHWD高、中剂量组血清中IL-1β、IL-6水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);补阳还五汤各剂量组血清中TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比较(n=10,ng/ml)

Table 2 Comparison of IL-6, IL-1β and TNF-α expression level in mouse serum among five groups(n=10,ng/ml)

组别IL-6 IL-1β TNF-α 空白对照组 40.76±8.5735.19±4.78153.27±20.53模型组107.24±10.02#77.58±5.74#359.06±29.69#补阳还五汤低剂量组 95.33±9.40#70.80±5.03#287.29±37.54#∗补阳还五汤中剂量组 71.83±8.94#∗56.92±5.84#∗194.62±25.05#∗补阳还五汤高剂量组 57.49±11.86∗44.36±7.31∗149.81±32.25∗

与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

2.3 背根神经节TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白的表达

与空白对照组比较,模型组TLR4,p-P38,p-IκB-α和p-P65蛋白表达均明显升高(P<0.05);与模型组对比,补阳还五汤高、中剂量组中的TLR4,p-P38,p-IκB-α和p-P65蛋白表达显著下降(P<0.05,见图1),呈剂量依赖性,各实验组中非磷酸化p38,IκB-α和P65表达不变,不受影响。

与正常组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05图1 各组小鼠背根神经节中TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白表达Figure 1 Expression of TLR4, p38 MAPK, p-P38, IκB-α, P65, p-IκB-α, and p-P65 proteins in the dorsal root ganglia in each group

3 讨论

DPN属中医学“气虚”“血瘀”范畴,病位在血络,消渴先发为本,DPN继发为标,由虚致实、虚实夹杂,其基本病机概括为气阴两虚,瘀血阻络。气虚则血行不畅,阴虚则血行涩滞,致使痰瘀互结,痹阻脉络,不通则痛,故见肢体[6]。而西医理论则认为DPN的病理生理的基础是由于神经血管内皮损伤,进而导致大脑血液供应不足引起的[7]。补气活血、祛瘀通络为补阳还五汤的功效,能显著改善病人血液循环状态,提高病人体质,对改善患者预后具有重要的作用。db/db小鼠是一种基因突变诱导的自发性2型糖尿病模型小鼠,是对瘦素受体基因进行突变导致的,是科研界用于研究2型糖尿病理想的动物模型之一。db/db小鼠生长至8周后,小鼠的周围神经就开始自发性的病变,主要表现为髓神经纤维缺失和髓鞘脱落[8],坐骨神经髓鞘的厚度显著减少[9],触觉神经异常性疼痛和足底热痛觉明显减退[10]等。

有研究报道,在db/db小鼠的脊髓背角和坐骨神经中,炎性因子IL-1β、TNF-α等的表达水平均明显上升[11,12],表明炎症反应与db/db小鼠周围神经病变有着紧密的联系,炎性因素在糖尿病及其并发症的发生发展中起重要作用。本实验结果表明,相比于空白对照组,db/db模型小鼠的热敏反应时间显著增加。相比于模型组,给药组db/db小鼠热敏反应时间均显著减少,其中以高剂量组较为显著,约为模型组的两倍,这提示补阳还五汤对db/db小鼠周围神经的神经感觉功能具有较好的改善作用。在给药组中,随着剂量的增加,db/db小鼠热敏反应时间相应降低,这表明阳还五汤对db/db小鼠周围神经的神经感觉功能的改善作用呈剂量依赖性。

大量研究已表明,TLR4信号通路在DPN的炎症反应中扮演重要的角色,其中TLR4可通过其下游MyD88依赖性以及非依赖性信号转导通路来产生各种炎症介质和因子。MyD88依赖性信号通路中参与细胞内信号转导的分子有MyD88,TRAF-6等,经过一系列信号转导后,激活MAPK,NF-κB等信号通路,导致促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,诱发炎症反应[13-15]。通过抑制TLR4信号通路,可抑制糖尿病神经病变的进展[16]。为此,本研究初步探讨了不同剂量补阳还五汤对db/db小鼠血清及背根神经节中相关炎性因子的影响。实验观察到补阳还五汤干预后,小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α及背根神经节TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α及p-P65蛋白的表达显著降低,表明补阳还五汤在一定程度上抑制了TLR4的活化,减少炎症因子释放,降低免疫反应的放大程度,并进一步缓解周围神经组织损伤,达到改善周围神经病变的效果。实验结果进一步提示,补阳还五汤的干预作用具有一定的剂量依赖性,以高剂量的作用效应最优。

综上所述,补阳还五汤对DPN小鼠机体炎症反应的保护作用可能通过抑制DPN中TLR4信号通路的激活,抑制下游炎症因子表达,从而改善糖尿病周围神经病变,但其具体调控机制,尚需进一步研究。