氮肥用量优化对甜玉米氮肥吸收利用率及氮循环微生物功能基因的影响

徐如玉　左明雪　袁银龙　孙杰　顾文杰　卢钰升　解开治　徐培智

摘要：【目的】研究氮肥用量優化对甜玉米氮肥利用率及根际土壤氮循环微生物功能基因的影响，为农业生产中氮肥减施及高效利用提供参考。【方法】在磷、钾肥用量优化一致的基础上，设3个施氮水平：（1）对照，不施氮;（2）常规施氮水平，氮用量420 kg/ha;（3）优化施氮水平，氮用量330 kg/ha。玉米成熟期采集植株样品及土壤样品，采用常规分析、根际土壤高通量测序和功能基因芯片（GeoChip 5.0）技术，对不同氮肥用量处理甜玉米产量、可溶性糖含量、土壤氮肥利用率、细菌群落结构及氮循环功能基因进行分析。【结果】与对照相比，优化施氮水平与常规施氮水平均能显著提高甜玉米鲜苞产量（P<0.05，下同），但二者间无显著差异（P>0.05，下同），优化施氮水平的可溶性糖含量最高（122.2 mg/kg），显著高于常规施氮水平（113.8 mg/kg），氮肥吸收利用率和氮肥偏生产力也分别较常规施氮水平处理提高8.5%（绝对值）和7.7 kg/kg。9个土壤样品16S rRNA高通量测序共检测到144736个OTUs，分属于46门106纲213目289科404属。优化施氮水平与氮循环相关的固氮菌属Rhodanobacter和Bradyrhizobium的相对丰度高于常规施氮水平，而氨氧化细菌Bryobacter和硝化作用细菌Candidatus_Nitrocosmicus的相对丰度则低于常规施氮水平。采用GeoChip 5.0技术在9个土壤样品中共发现了2752个氮循环基因，分属于8个亚类功能。其中固氮、氨化、硝化、同化氮还原、氮同化和异化氮还原等作用表现为优化施氮水平高于常规施氮水平，除固氮作用外，两个处理间差异显著;氨氧化作用表现为常规施氮水平高于优化施氮水平，但两个处理间差异不显著。【结论】氮肥用量优化有助于调控参与氮循环关键环节的细菌菌属丰度，促进氮循环微生物功能基因的固氮作用和氨化作用，提高土壤氮肥吸收利用率和甜玉米可溶性糖含量，且甜玉米鲜苞产量与常规施氮水平相当，在氮肥减量增效的同时达到甜玉米稳产提质的效果，可作为推荐施肥方式进行推广应用。

关键词： 甜玉米;氮肥用量;根际土壤氮循环;细菌群落;高通量测序;功能基因芯片

中图分类号： S143.1                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2919-08

Abstract：【Objective】To study the effects of nitrogen fertilizer application optimization on nitrogen fertilizer utilization efficiency and microbial functional genes of nitrogen cycle in rhizosphere soil of sweet corn， and to provide reference for nitrogen fertilizer reduction and efficient utilization in agricultural production. 【Method】The optimized dosages of phosphorus and potash fertilizer were the same， three nitrogen application levels were set in this experiment ：（1） control， no nitrogen application;（2）conventional nitrogen application level， nitrogen dosage 420 kg/ha;（3） the nitrogen application level was optimized， and the nitrogen dosage was 330 kg/ha. Plant samples and soil samples were collected during maize maturity. The yield， soluble sugar content， soil nitrogen utilization efficiency， bacterial community structure and nitrogen cycle function genes of sweet corn treated with different nitrogen fertilizer dosages were analyzed by conventional sweet corn index analysis， high throughput sequencing of rhizosphere soil and GeoChip 5.0 technology. 【Result】Compared with the control， the results of this study showed that both optimized and conventional nitrogen levels could significantly increase the fresh ear yield of sweet corn （P<0.05， the same below）， there was no significant difference between the fresh ear yield of sweet corn treated with optimized nitrogen application level and that treated with conventional nitrogen application level（P>0.05，the same below）. The soluble sugar content was the highest in the treatment with optimized nitrogen application level（122.2 mg/kg） which was significantly higher than the conventional nitrogen application level（113.8 mg/kg）. The results showed that the nitrogen recovery efficiency and nitrogen partial productivity were increased by 8.5%（absolute value） and 7.7 kg/kg. At the same time， 144736 OTUs were detected after 16S rRNA high-throughput sequencing was performed on 9 soil samples， which belonged to 404 genera， 289 families， 213 orders， 106 classes and 46 phylum. The results of relative abundance of Rhodanobacter and Bradyrhizobium were higher than that of conventional nitrogen application， while the results of relative abundance of Bryobacter and Candidatus_Nitrocosmicus were lower than that of conventional nitrogen application. A total of 2752 nitrogen cycle genes were found in 9 soil samples using GeoChip 5.0 technology， and the functions of these genes were divided into 8 subclasses. The effects of nitrogen fixation， ammoniation， nitrification， nitrogen assimilation reduction， nitrogen assimilation and nitrogen alienation reduction on nitrogen substances were shown as that the optimized nitrogen application level treatment was higher than the conventional nitrogen application level treatment. Except biological nitrogen fixation， the difference between the two treatment groups was significant. The effect of ammonia oxidation mainly showed that the conventional nitrogen application level treatment was higher than the optimized nitrogen application level treatment， but the difference between the two treatment groups was not significant. 【Conclusion】The improvement of the amount of nitrogen fertilizer used in crops can help regulate the bacterial species abundance of crops that participate in the key link of the nitrogen cycle， so as to promote the nitrogen fixa-tion and ammoniation of microbial functional genes in the nitrogen cycle， ultimately improve the uptake and utilization rate of nitrogen fertilizer in plant soil and soluble sugar content of sweet corn， and the fresh ear yield of sweet corn is equivalent to that of conventional nitrogen application level， which can achieve the effect of stable yield and quality improvement of sweet corn while reducing nitrogen fertilizer and increasing efficiency. This treatment can be promoted as a recommended fertilization mode.

Key words： sweet corn; nitrogen fertilizer dosage; nitrogen cycle in rhizosphere soil; bacterial community; high-throughput sequencing; functional gene chip

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0200706）;Science and Technology Planning Project of Guangdong（2016A030313776，2017B020233002，2017B020203002）

0 引言

【研究意义】氮素是对作物生长发育及产量品质影响最大的必需矿质营养元素。近年来，盲目增施氮肥追求高产导致农田氮肥投入量过高而氮肥利用率偏低，不仅浪费了肥料资源，还带来了一系列环境问题（时成俏等， 2011;杨小梅等， 2013;周晶等， 2016）。土壤氮循环与根际微生物密切相关，根际微生物是土壤和植物养分吸收、转运的重要纽带。肥料的施用不仅会影响土壤养分与作物生长，也会影响根际土壤微生物的群落结构组成（陈春兰等，2011;彭卫福，2017;李明松，2018;马鹏等，2020）。明确土壤氮转化相关微生物菌属及氮循环功能基因的强度，对促进土壤氮素转化及提高氮肥利用率均具有重要意义。【前人研究进展】近年来，越来越多的报道表明长期施氮肥显著影响与氮循环相关的微生物群落结构。Ai等（2013）、侯海军等（2014）研究发现，长期施氮会影响氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的群落结构，进而影响硝化作用，还会导致氨氧化菌群丰度的变化;当土壤中的氨分子浓度过高时，在酸性土壤中，氨氧化细菌的群落组成以Nitrosospira cluster 2为主。Zhao等（2014）研究发现，土壤中NH4+含量的提高会使Acidimicrobiia、Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria丰度提高，总氮含量的提高有利于Chloroflexi的生长繁殖。Jorquera（2014）等研究发现，长期施氮会影响固氮、硝化（氨氧化和亚硝酸盐氧化）和反硝化过程的微生物菌群。周志成等（2015）通过构建氨单加氧酶基因（amoA）克隆文库，发现长期施用氮肥能显著降低湖南酸性红壤中氨氧化古菌的丰度，并且氨氧化古菌在红壤的硝化作用中占主导作用。Yu等（2016）研究表明，氨氧化细菌的相对丰度随着施氮量的增加而逐渐升高。Zhong等（2016）研究发现，随着施氮量的增加，氨氧化古细菌和氨氧化细菌数量下降，说明施氮量对氨氧化细菌群落结构的影响更强。彭卫福（2017）研究表明，高肥力土壤能提高土壤微生物活性和生化作用强度，施氮能增强氨氧化细菌及反硝化细菌的丰度。【本研究切入点】氮肥施用过量是农业生产中的突出问题，化肥减量增效仍是施肥调控措施的首要目标，以往关于氮素转化的研究多集中在形态变化和理化性质对氮素循环的影响，近年来虽然有学者利用微生态分子生物技术如（16S rRNA、qPCR定量等技术）对于氮循环功能基因进行研究（储成等，2019;李慧等， 2019），但基于功能基因芯片GeoChip技术研究甜玉米土壤氮循环功能基因亚类功能的报道甚少。【拟解决的关键问题】本研究采用大田区组试验，利用16S rRNA高通量测序与功能基因芯片（GeoChip 5.0）技术，研究氮肥用量优化对甜玉米氮肥利用率及根际土壤氮循环微生物功能基因的影响，揭示甜玉米根际土壤细菌对不同氮肥用量水平的响应特征，探讨氮循环亚类功能基因在细菌优势属中的分布以及驱动甜玉米根际土壤氮循环的强度，以期为农业生产中氮肥减施及高效利用提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料及试验地概况

供试甜玉米（Zea mays L.）品种为粤甜28号，由广东省农业科学院作物研究所提供。

定位试验于2018年春季开始在广东省惠州市惠阳区农业技术推广中心试验基地（东经113°20′，北纬23°08′）进行，一年春秋两季栽培。试验区气候类型为亚热带季风气候，年均降水量800～1500 mm，年均气温13～22 ℃;土壤类型为赤红壤，土壤理化性质：有机质21.89 g/kg、pH 5.1、碱解氮191.5 mg/kg、有效磷59.1 mg/kg、速效钾224.1 mg/kg。

1. 2 试验方法

广东省甜玉米氮肥用量调研数据显示，甜玉米常规施氮水平为420 kg/ha。通过测土配方和前期7个不同氮肥用量优化筛选试验，本研究在磷、钾肥用量优化一致的基础上，设3个施氮水平：（1）对照，不施氮肥;（2）常规施氮水平，氮用量420 kg/ha;（3）优化施氮水平，氮用量330 kg/ha。每处理3次重复，随机区组排列，共9个小区，小区面积为67.5 m2（4.5 m×15.0 m）。各处理磷肥用量150 kg/ha（以P2O5计），钾肥用量225 kg/ha（以K2O计）。氮、磷、钾肥品种分别为尿素（N 46%）、过磷酸钙（P2O5 12%）和硫酸钾（K2O 50%）。氮肥基施20%，苗期（10月10日）和拔节期（10月28日）分别追施30%和50%，磷肥作为基肥一次性施入土壤，钾肥在基肥和拔节期各施入50%。甜玉米实行起垄种植，种植密度为45000 株/ha。其他田间管理同当地常规大田。试验于2019年9月18日移苗，12月10日收获。

1. 3 植株样品采集及測定

收获期选取各处理中10株长势一致的植株整棵挖出，植株地上部分称重、杀青（105 ℃下杀青30 min）、烘干（75 ℃烘干至恒重）、称重和粉碎后测定地上部分全氮含量。甜玉米鲜苞产量采用全小区实收测产，并折算为公顷产量。植株样品经H2SO4—H2O2消煮碱化后，采用凯氏定氮法测定植株全氮含量;甜玉米可溶性糖含量采用蒽酮法测定（鲁如坤， 1999）。参照黄巧义等（2017）的方法计算以下参数：

地上部分吸氮量（kg/ha）=地上部分生物量×地上部分含氮量

氮肥偏生产力（kg/kg）=施氮区鲜苞产量/施氮量氮肥吸收利用率（%）=（施氮区地上部分吸氮量?对照区地上部分吸氮量）×100/施氮量

1. 4 土壤样品采集及16S rRNA高通量测序

供试土壤样品采集于2019年秋季甜玉米成熟期（12月10日），采用抖根法（Inderjit，1997）获取甜玉米根际土壤放入无菌密封袋密封后用冰盒带回实验室于-80 ℃保存，用于16S rRNA高通量测序及基因芯片检测。

采用土壤DNA提取试剂盒（MinkaGene Soil DNA Kit）对土壤样品进行总DNA提取，利用NanoDrop One检测DNA的完整性、纯度和浓度。使用带barcode的特异引物F515（5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'）和R806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌V4区域进行PCR扩增（Zhang et al.，2017）。PCR反应体系50 μL：2×PCR Mix 25 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，10 mmol/L正、反向引物各1 μL，ddH2O 20 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环;72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。将扩增产物用琼脂糖凝胶回收、纯化洗脱并用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，长度在正常范围（16S V4：290～310 bp）内。

建库及测序：按照NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs， USA）标准操作流程进行建库，并委托广东美格基因科技有限公司应用Illumina HiSeq 2500 平台对构建的扩增子文库进行上机测序。

1. 5 根际土壤微生物功能基因芯片分析

采用Cy3染料和DNA聚合酶I对纯化后的DNA进行标记，采用QIAquiT1 PCR Purification Kit纯化标记的DNA，置于Labconco Centrivap浓缩器中50 ℃干燥45 min，DNA稀释至相同浓度后在95 ℃下孵育5 min，并在42 ℃下进行杂交16 h，将标记的DNA置于阵列上，然后在杂交站（BioMicro Systems， Inc.，Salt Lake City，UT）将阵列预热至42 ℃（5 min），最后用NimbleGen MS200扫描仪进行预处理和信号强度的标准化。

1. 6 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0进行统计分析，采用GraphPad Prism 8制图，处理间的差异显著性采用单因素方差分析进行LSD检验（P<0.05）。

2 结果与分析

2. 1 不同氮肥用量对甜玉米产量、可溶性糖含量和氮效率的影响

由表1可知，与对照相比，常规施氮水平和优化施氮水平均能提高甜玉米鲜苞产量、可溶性糖含量及地上部分吸氮量，其中甜玉米鲜苞产量分别较对照显著提高132.0%和123.7%（P<0.05，下同），但优化施氮水平与常规施氮水平间鲜苞产量无显著差异（P>0.05，下同）。优化施氮水平的氮肥吸收利用率和偏生产力分别较常规施氮水平提高8.5%（绝对值）和7.7 kg/kg。

2. 2 不同氮肥用量对细菌群落结构的影响

3个处理9个土壤样品的16S rRNA高通量測序共检测到144736个OTUs，分属于46门106纲213目289科404属。本研究测序深度达到80%时，已基本覆盖土壤样品的绝大部分物种，继续增加测序深度未发现更多新物种，说明测序结果可靠。前25个细菌属水平群落结构组成分析结果如图1所示，细菌群落菌属丰度总体上表现为优化施氮水平>常规施氮水平>对照。ADurb.Bin063-1、Geobacter、Rhodanobacter、Mucilaginibacter、Pajaroellobacter、Bradyrhizobium、Bacillus和Conexibacter的相对丰度表现为优化施氮水平显著高于常规施氮水平;Candidatus_Nitrosotales的相对丰度表现为对照>常规施氮水平>优化施氮水平;常规施氮水平的Candidatus_Nitrosotales和Candidatus_Nitrocosmicus菌属相对丰度分别比优化施氮水平高0.6%和0.1%。Bryobacter和Gemma-timonas菌属的丰度在优化施氮水平和常规施氮水平上无显著差异。但优化施氮水平Bryobacter的相对丰度低于常规施氮水平。

2. 3 氮循环关键功能基因

采用GeoChip 5.0技术在9个土壤样品中共发现2752个氮循环基因，分属于8个亚类功能，分别具有固氮、氨化、硝化、反硝化、同化氮还原、氮同化、异化氮还原和氨氧化等作用。除氨氧化作用表现为常规施氮水平高于优化施氮水平外，其他7个氮循环亚类功能强度均表现为优化施氮水平高于常规施氮水平。优化施氮水平的固氮和异化氮还原作用与常规施氮水平差异不显著;氨化、硝化、同化氮还原和氮同化作用均表现为优化施氮水平显著高于常规施氮水平;反硝化作用相对强度表现为优化施氮水平>对照>常规施氮水平，但各处理间差异不显著。

2. 4 亚类氮循环功能基因在细菌优势属中的分布及相关性

8个氮循环亚类功能在前25个细菌菌属中的分布情况如表2所示，其中Geobacter和Bradyrhizobium具有固氮作用基因;Haliangium、Gemmatimonas、Mucilaginibacter、Bacillus和Bradyrhizobium具有氨化作用基因;Rhodanobacter、Gemmatimonas、Baci-llus和Bradyrhizobium具有反硝化作用基因;Sphingomonas和Bradyrhizobium具有同化氮还原作用基因，Anaerolinea、Geobacter、Bacillus和Bradyrhizobium具有异化氮还原作用基因。通过对细菌优势属与亚类氮循环功能基因的相关性进一步分析，结果（表3）表明，与氨化作用显著相关的细菌菌属为Mucilaginibacter和Bradyrhizobium。

结合细菌群落特征进一步分析表明，与氮循环密切相关的细菌菌属Geobacter、Bradyrhizobium、Mucilaginibacter、Bacillus和Rhodanobacter的相对丰度表现为优化施氮水平显著大于常规施氮水平;Sphingomonas的相对丰度表现为常规施氮水平>对照>优化施氮水平;Haliangium和Gemmatimonas 2个菌属的相对丰度在优化施氮水平和常规施氮水平间无显著差异。由此表明，优化施氮促进了氮循环的固氮、氨化、反硝化和异化氮还原作用，常规施氮水平促进了同化氮还原作用。

3 讨论

3. 1 不同氮肥用量对甜玉米产量、可溶性糖含量和氮效率的影响

施氮量是影响甜玉米物质累积及产量形成的主导因素。陈建生等（2010）认为甜玉米的最佳经济施氮量一般在370 kg/ha左右;程杏安等（2011）研究指出，甜玉米氮肥用量为300 kg/ha时既能保证叶面积和穗长等产量性状得到有效提高，也不会导致氮肥过量引起氮营养过剩;赵福成等（2013）研究显示，扬甜2号和超甜135甜玉米的鲜穗产量随施氮量的增加先升高后降低，以施氮量为225 kg/ha时产量最高。合理的氮肥用量不仅能提高甜玉米鲜苞产量，还能提高甜玉米的可溶性糖含量，但过量施氮可能影响到正在发育籽粒的碳氮代谢，不利于产量形成和氮肥吸收利用率的提高（Osaki et al.，1995）。本研究中，优化施氮水平的可溶性糖含量、氮肥吸收利用率和偏生产力均高于常规施氮水平，且鲜苞产量与常规施氮水平无显著差异，说明优化施氮水平在减氮90 kg/ha的基础上，既能满足甜玉米优质高产，又能提高氮肥吸收利用率，可作为推荐氮肥减施方案推广应用。

3. 2 氮优化对甜玉米细菌群落结构的影响

土壤微生物参与土壤中多种物质的循环，对土壤氮循环起着重要作用。施用肥料在影响作物生长的同时，还能影响土壤微生物群落结构组成（张晶等，2009）。近年越来越多的报道表明，长期施氮肥显著影响与氮循环相关的微生物群落结构。Jorquera（2014）等发现长期施氮影响包括固氮、硝化（氨氧化和亚硝酸盐氧化）和反硝化过程的微生物菌群。Yu等（2016）、Zhong等（2016）等得出氨氧化细菌的相对丰度随着施氮量的增加而逐渐升高。彭卫福（2017）研究表明，高肥力土壤能提高土壤微生物活性和生化作用强度，施氮能增强氨氧化细菌的丰度。Brussaard等（2007）、李明松（2018）研究表明，过量施氮会造成土壤酸化，不利于细菌群落的生长。本研究结果表明，氨氧化细菌Bryobacter的相对丰度表现为常规施氮水平高于优化施氮水平，与前人研究结果一致。周丽等（2017）的研究表明氮肥减量能增强土壤硝化作用，与本研究结果一致，优化施氮水平中硝化作用细菌Candidatus_Nitrocosmicus相对丰度低于常规施氮水平。硝化作用作为氮循环的关键过程，在氮循环中发挥重要作用，为反硝化作用提供一定的底物，因此在优化施肥处理中可能通过影响硝化作用进一步影响反硝化作用。

不同施氮水平可导致土壤中的优势固氮菌群落结构不同（陈春兰等，2011）。本研究发现，优化施氮水平的固氮菌属Rhodanobacter和Bradyrhizobium的相对丰度显著高于常规施氮水平。Coelho等（2008）研究表明，生物固氮过程需要消耗大量能量，在很大程度上依赖土壤中的有机碳含量，氮肥能显著提高土壤有机碳，从而提高固氮菌属的丰度。而周晶（2017）研究表明，固氮微生物的数量和种类与施入土壤的外源氮素密切相关，但施氮量过高也会抑制固氮微生物的生长。因此，适量施氮有助于协调氮循环各环节的菌属丰度，从而形成良好的土壤氮循环，促进氮高效利用。

3. 3 氮优化对甜玉米根际土壤氮循环微生物功能基因的影响

微生物功能基因芯片主要获取大量微生物群落参与生物化学过程的可靠性，尤其是微生物功能基因。本研究中3个处理共检测出8个氮循环亚类功能，其中氨氧化作用表现为常规施氮水平高于优化施氮水平。与此对应的氨氧化细菌也有同样的变化趋势，与Yu等（2016）、彭卫福（2017）研究得出的施氮能增强氨氧化细菌丰度的结果一致。固氮作用表现为优化施氮水平高于常规施氮水平，也与优化施氮水平中固氮菌属相对丰度高于常规施氮水平相一致。周晶（2017）关于长期施氮对东北黑土微生物及主要氮循环菌群影响的研究中也得出了相同结论，即合理施氮能在一定程度上增加固氮菌属的丰度，从而增加菌属固氮作用，施氮量过高会降低固氮基因的丰度。如Bradyrhizobium和Geobacter 2个固氮菌属的相对丰度表现为对照<優化施氮水平>常规施氮水平。因此，施氮量能通过影响微生物群落结构及菌属丰度来调节氮循环亚类功能。通过氮循环亚类功能在细菌优势菌属的分布和相关分析，得出氮循环亚类功能中的固氮、氨氧化、反硝化、同化氮还原和异化氮还原作用在前25个菌属中有9个细菌菌属分布，并且与氨化作用显著相关的细菌菌属有Mucilaginibacter和Bradyrhizobium。张晶等（2009）报道指出，Candidatus_Nitrocosmicus、Bryobacter和Pseudolabrys具有氮循环亚类功能。但本研究中氮循环亚类功能在这些细菌菌属中并未体现分布，这主要是由于在基因芯片中功能基因对应的物种是以该基因最早发现的物种信息命名。

4 结论

氮肥用量优化有助于调控参与氮循环关键环节的细菌菌属丰度，促进氮循环微生物功能基因的固氮作用和氨化作用，提高土壤氮肥吸收利用率和甜玉米可溶性糖含量，且甜玉米鲜苞产量与常规施氮水平相当，在氮肥减量增效的同时达到甜玉米稳产提质的效果，可作为推荐施肥方式进行推广应用。

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（責任编辑 王 晖）