氯甲基吡啶通过抑制AOB降低有机施肥下碱性土壤硝化作用

2020-03-24邓宇淋罗加明褚贵新

绍兴文理学院学报(自然科学版) 2020年1期

付龙邓浩代婧邓宇淋罗加明李君褚贵新陶瑞

(绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴 312000)

0 引言

本试验在25 ℃的培养条件下，以碱性石灰性土壤为研究对象，研究有机无机肥配施硝化抑制剂氯甲基吡啶对土壤氮素转化和氨氧化微生物群落数量、功能和结构的影响，以期阐明土壤硝化过程微生物对有机施肥和抑制剂添加的响应机制，为农田生态系统氮素优化管理提供理论依据.

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用碱性土壤，取自新疆石河子(86°06′E，44°32′N)，采取耕层0～0.2 m土壤带回实验室去除砾石和根系等杂质，自然风干后过2 mm筛后保存待用.土壤基础理化性质包括有机质含量13.5 g·kg-1；全氮0.95 g·kg-1；全磷0.30 g·kg-1；碱解氮88.6 mg·kg-1；速效磷23.4 mg·kg-1；速效钾136.0 mg·kg-1；pH值8.1.尿素含氮量46.0%，腐熟牛粪，有机质含量：38.8%，含N：1.5%，含P2O5：2.01%，含K2O：0.21%；CP(纯度为99.7%)由浙江奥复托有限公司提供，用量为纯N量的2.5‰.

1.2 试验设计

土壤微域模拟试验设置4个处理，每个处理4次重复，培养温度25 ℃，分别为：(1)CK(不施肥)；(2)CF(100%尿素N处理)；(3)COM(60%尿素N+40%牛粪N)；(4)COM+CP(60%尿素N+40%牛粪N+硝化抑制剂CP).除CK外，所有施肥处理的纯N用量为0.35 g·kg-1干土，保持各处理N含量一致.

1.3 培养方法

1.4 土壤分析

1.4.1 土壤化学性质测定

1.4.2 氨氧化微生物基因拷贝数测定

土壤总NDA的提取：土壤样品DNA提取使用Powersoil © DNA Isolation Kit(MoBio,San Diego,美国)，每个土壤样品称0.35 g，土壤DNA提取参照试剂盒说明书进行.提取好的DNA采用Nanodrop 2000分光光度计(Nano Drop Technologies Inc，USA)检测浓度.将提取好的DNA稀释10倍后保存在-20 ℃下备用.

利用qPCR技术测定硝化微生物的基因拷贝数.用来扩增硝化功能基因的PCR引物如表1所示.其中AOA和AOB的引物分别为amoAF，amoAR(Francis等，2005)和amoA1F和amoA2R(Rotthauwe等，1997)，反应条件为95 ℃ for 2 min×1 cycle；95 ℃ for 20 s，55 ℃ for 20 s，72 ℃ for 30 s，80 ℃ for 15 min×40 cycles；扩增效率分别为92%和96%.结果以每克干土重的基因拷贝数(copies·g-1)表示.

1.4.3 高通量测序技术的测定

利用Illumina MiSeq平台对AOA和AOB进行高通量测序，引物选取同qPCR一致，采用滑动窗口法对双端的FASTQ序列做质量过滤，利用软件FLASH(version1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对通过质量过滤的序列进行连接，对连接上的序列进行过滤和去除嵌合体，得到优质序列.基于OTU聚类和注释的分析结果，进行AOA和AOB多样性分析.

1.5 数据处理

用Microsoft Excel2019和SPSS23.0进行数据整理和计算，用GraphPad Prism version7.04进行绘图.

2 结果与分析

2.1 有机无机肥与硝化抑制剂联用对土壤氮素转化的影响

图1 土壤和含量变化

2.2 不同施肥处理下土壤pH和EC动态变化

由图2(a)可知，土壤pH变化在培养周期内各个处理的动态变化都是先上升后下降，在CF处理的第7 d达到峰值.但后期下降快于COM+CP和CK处理.由图2(b)可知，土壤EC变化与pH变化相反，EC变化是先上升然后趋于稳定，COM+CP的处理的电导率总体要低于COM和CF处理，说明有机无机肥配施添加硝化抑制剂CP会减轻土壤酸化和发生次生盐渍化的风险.

图2 不同处理土壤pH和电导率的动态变化

COM和COM+CP处理的SOC、全氮、速效钾、速效磷和CEC含量相比CK和CF处理有明显地提高(P<0.05).COM处理相比CF处理显著地增加了MBC和MBN含量，而硝化势有降低但差异不明显.COM+CP处理相比COM处理则显著地降低了土壤的微生物量，其中MBC降低了71.4%,由此说明，施肥显著增加了土壤生物和化学质，而配施硝化抑制剂CP会降低土壤的微生物量碳和微生物量氮.

表1 土壤各处理生物化学性质的变化

处理SOC全氮全磷速效钾速效磷CECMBCMBN g·kg-1g·kg-1g·kg-1mg·kg-1mg·kg-1cmol(+)kg-1mg·kg-1mg·kg-1CK15.7±0.461.4±0.060.4±0.0455.7±1.15106.1±0.6014.8±0.67121.4±29.1630.8±6.91CF15.9±0.521.6±0.060.4±0.0754.4±0.36107.3±0.6023.6±4.40150.5±38.8039.1±4.57COM18.7±0.461.8±0.040.5±0.0471.9±2.58130.9±1.2029.6±1.42221.8±59.2774.4±8.91CP18.0±0.161.9±0.070.4±0.0673.5±0.96134.3±0.5231.1±2.5263.4±25.8723.8±1.73

2.4 氨氧化微生物群落结构的变化

由图3可知，不同的施肥处理对AOA的结构没有明显的影响，而对AOB群落产生了明显变异.在第一排序轴上，COM或CF与CK及COM+CP明显分离.此外，在第2分类轴上，COM+CP与CK显著分开.这些结果表明，AOB群落相比于AOA群落对有机肥和硝化抑制剂CP添加更敏感.

图3 不同施肥处理下AOA与AOB菌群多样性变化

2.5 氨氧化微生物基因数量的变化

由图4(a)可以看出，在不同施肥处理中，AOAamoA基因拷贝数无显著差异，AOBamoA基因拷贝数范围从1.1×106-4.2×106g-1干土，不同施肥制度之间的AOB数量有显著差异.与CK相比，CF和COM处理显著地提高了AOB的菌群数量.COM处理相比CF处理有提高但差异不显著，COM+CP处理相比COM处理显著降低了AOBaomA基因拷贝数.由图4(b)可以看出，土壤的硝化势与土壤AOA的基因拷贝数没有显著的相关性(R2=0.295 4，P=0.168 6)，而与土壤AOB的基因拷贝数呈现显著的相关性(R2=0.320 9，P=0.017 9).说明在此有机增碳添加抑制剂的条件下，土壤硝化作用与AOB更紧密相关.

图4 不同施肥处理下AOA与AOB基因数量的变化及土壤硝化势的关系

2.6 不同土壤化学性质对氨氧化微生物数量的相对贡献

图5 不同土壤理化性质对氨氧化微生物的相对贡献值

3 讨论

3.1 有机无机肥配施硝化抑制剂对AOA和AOB的影响

在本研究中，AOB基因数量与土壤潜在硝化势存在显著的相关性(P<0.05)，而与AOA无显著关系(P>0.05)，说明AOB可能主导施肥下石灰性土壤的硝化过程，同时，有机肥联合CP施用显著降低了AOB的基因数量，且改变了其群落结构，而对AOA没有明显抑制作用.本研究结果与赵伟烨等[7]的研究类似.贺纪正等[8]的研究也表明碱性土壤中不同施肥处理对AOB的数量及组成有明显影响而对AOA的影响较小.吴玲等[9]在对太湖生态环境的研究发现太湖表层沉积物中总氮含量显著影响AOB群落丰度.在本研究中，不同施肥处理未使AOA种群丰富度变化的主要原因可能是AOA喜欢低pH和养分贫瘠的土壤环境，Auguet等[10]的研究也证明AOA的耐酸和耐土壤养分贫瘠生态位.本研究结果显示有机无机配施会一定程度上增加AOB基因数量，这表明石灰性土壤在有机肥添加后会促进AOB的增长，这与He等[16]的研究结果一致，他发现在有机质肥沃的土壤中AOB/AOA的比例比未施肥的土壤高.相似地，Taylor等[17]观察到AOB相比AOA对肥料处理更加敏感.Di等[18]研究表明，AOA较AOB有着更好的抗逆性，在氮含量较高的草地生态系统中，AOB是硝化过程的主导者.虽然在本实验的培养条件下，不同施肥条件下的AOA基因拷贝数基因数量并没有显著变化，但AOA在硝化过程中仍可能扮演着重要的作用，Ouyang等[19]研究证实虽然AOB对环境扰动响应更敏感，但AOA同样对硝化起重要的作用.一般在酸性土地中，缺乏氮肥的情况下，硝化过程主要由AOA来驱动[20].综上所述，在土壤肥沃、碱性的土地中，AOB在硝化过程中扮演着更加重要的角色，并且对有机肥和硝化抑制剂氯甲基吡啶施用更敏感.