假博路定的鉴别研究

滕海堂，金 鹏，胡 珀，鲁素雅

淮安市食品药品检验所，淮安223001

恩替卡韦（entecavir）（商品名为博路定）为美国百时施贵宝公司研制开发的一种抗乙肝病毒药物，2005 年被批准在中国上市，用于治疗慢性乙型肝炎（CHB），疗效优于拉米夫定[1]。

“4+7”药品集中采购[2]之前，博路定价格较高，某些不法分子以低价之名，通过互联网向患者出售假冒“博路定”以牟取暴利。为顺利开展博路定的日常打假和药品流通监督，笔者建立了液质联用辅以外观鉴别的方法，能有效辨别博路定真、伪品。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

梅特勒XS205DU 电子天平；Waters 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；薄层扫描仪、Agilent 6540 四级杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 药品与试剂

博路定真品（批号AAZ5491，规格0.5 mg，中美上海施贵宝制药有限公司）；博路定假品（批号AAN6855，规格0.5 mg，网购品）；恩替卡韦胶囊（批号180304，规格0.5 mg，正大天晴制药有限公司）；阿德福韦酯片（批号201805092，规格10 mg，江苏天士力帝业药业有限公司）；对照品：恩替卡韦（纯度93.6%，批号101248-201804），阿德福韦酯（纯度98.9%，批号100576-201802），拉米夫定（纯度99.7%，批号101007-201502），均购于中国食品药品检定研究院；富马酸替诺福韦二吡呋酯（内标，纯度98.0%）；富马酸替诺福韦艾拉酚胺（内标，纯度99.0%）。乙腈为色谱纯；三氟乙酸、盐酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药品外观性状鉴别[3]

真、伪品外观的主要区别在于：内包装铝塑板的铝膜上，真品商品名处平视呈暗蓝色、斜视呈亮蓝色防伪变色光，企业标识在365 nm 紫外灯下呈明显的荧光；伪品铝膜的商品名处无防伪变色光，企业标志也无荧光。

2.2 实验室验证

2.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Exlend Plus C18（2.1mm×50mm，1.8μm）；以0.02mol·L-1乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相A，乙腈为流动相B（梯度洗脱：0～5 min，99%A；5～10 min，99%A→20%A；10～11 min，20%A）；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子检测，毛细管电压：4000 V，锥孔电压：65 V，离子源温度：350 ℃，干燥气流速：10 L·min-1，扫描范围：50～1000 m/z，扫描方式：一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，碰撞能量：10～35 V。

2.2.3 测定方法 分别取对照品恩替卡韦、阿德福韦酯各约20 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇20 mL 溶解，放冷后加入0.01 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置100 mL 量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。

取伪品1 片研磨成粉，精密称定，置50 mL 量瓶中，加0.01 mol·L-1盐酸溶液适量，超声溶解，放冷，0.01 mol·L-1盐酸定容至刻度，摇匀，取溶液适量，以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，滤过，即得。

精密量取对照品溶液和伪品溶液各1 μL，注入液-质联用仪，记录液相色谱图（见图1）和一、二级质谱图（见图2）。

2.2.4 检测结果 从图1、图2 看出，在博路定伪品色谱中，检出与阿德福韦酯对照品色谱保留时间、一级质谱图和二级质谱图一致的色谱峰（见表1）。

表1 阿德福韦酯对照品和博路定伪品色谱的保留时间及一级、二级质谱特征

2.2.5 检测筛查其他抗乙肝药物 以上述方法为基础建立质谱同时鉴别几种抗乙肝药物方法，结果如图3、图4。

由以上几种抗乙肝药的液相色谱图、质谱图，可在一定范围内与伪品比对，明确其是何种成分。

3 讨论

药品外观鉴别是现阶段用来鉴别伪药的初始方法，包括内外包装、防伪特征和药品性状等。这种方法相对比较粗浅简单，还要依赖于患者长期服用的这种药品，且对该药外观有着清楚的了解方可感知。笔者发现，现有博路定伪药外包装真假无明显差异，而内包装差异性很大，很可能制假者从患者等途径回收的外包装和说明书，然后再压制普通包衣片，实现造假源头的第一步。但是内包装防伪标识为企业核心技术，生产企业因涉密未公开，这也是制假者的最大缺陷漏洞。因此，患者、药品监督人员及流通单位人员可以利用外观初步辨别真、伪药品。

近红外光谱法[4]是十分常见的快速检验方法，其最大的优势为取样少、无损伤，不仅能够检查药品制剂中活性成分，还能检测辅料不同的形态以及种类，如原料药、蛋白质、中草药、胶囊、片剂、分散片等[5]。同品种、同剂型因不同厂家生产工艺及辅料差异而呈现出不同NIR 光谱。目前国内恩替卡韦片主要由中美上海施贵宝制药有限公司和北京百奥药业有限责任公司生产，本文只收集到前者的博路定（恩替卡韦片），由于批次少，厂家少，故未能建立有效博路定近红外相关系数模型。有待国家局药品近红外一致性检验模型库数量增大、覆盖面进一步完善，满足基层药监快检需求。

液质联用仪能够精准地定性定量分析待测物，尤其未知样品。对未知物通过质谱解析快速判定分子量和分子式，有利于定位可能的化合物。通过比对可能的对照谱图，具体明确添假、掺假成分。本文仅研究5 种抗乙肝药物，有老药，也有目前一线药物，还有未上市新药，具有典型性，但未能囊括抗乙肝类药物，有待进一步扩大范围，提高检验覆盖面。