紫萍与青萍中黄酮类成分的测定及多变量统计分析

王秋实，张小龙，2，陈洪岩，吴啟南

1 连云港市食品药品检验检测中心，连云港 222006；2 南京中医药大学，南京210023

浮萍为浮萍科（Lemnaceae）植物的统称，现行《中国药典》 所收载的中药浮萍来源为浮萍科植物紫萍Spirodela polyrrhiza（L.）Schleid.的干燥全草[1]。其味辛、性寒，具有宣散风热、透疹、利尿的功效；可用于治疗麻疹不透、风疹瘙痒、水肿尿少等症。但是在历代“本草”中，有多部记载了浮萍科植物青萍Lemna minor L.也可作为浮萍药用的情况。

现代药理学研究认为，浮萍具有抗菌、抗炎、抗氧化等活性，主要是通过黄酮类成分发挥其药理药效作用。因此对浮萍中黄酮类成分的测定和分析有着重要意义。本研究采用HPLC-QTOF-MS 法对浮萍中的荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素等6 个黄酮类成分的含量进行了测定，并采用主成分分析（PCA)与正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等化学计量学方法，对青萍和紫萍间的差异进行了系统的定量、半定量研究，揭示紫萍和青萍中含有的黄酮类化合物的区别，为浮萍的合理利用与临床合理用药提供依据。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity HPLC（配备DAD 检测器、二元泵系统、高通量自动进样器及样品室温度控制模块）；Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF（电喷雾离子化，正离子模式）；AG135 十万分之一天平（Mettler Toledo 公司）；Ymnl-48 高通量组织研磨仪（南京以马内利仪器设备有限公司）；2-16R 台式高速冷冻离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：荭草苷（纯度97.9%，批号111777-201302）、异荭草苷（纯度94.0%，批号111974-201401）、牡荆苷（纯度95.7%，批号111687-201603）、木犀草苷（纯度94.9%，批号111720-201408）、木犀草素（纯度99.6%，批号111520-201605）、芹菜素（纯度99.2%，批号111901-201603）均购自中国食品药品检定研究院。

来源于不同产地的52 批浮萍样品由实验室自采，其中31 批为紫萍样品（SP 01～31）、21 批为青萍样品（LM 01～21），均经南京中医药大学吴啟南教授鉴定确认。将采集的样品用清水洗净并去除杂质后晒干，密封于自封袋中置阴凉干燥处保存备用。

甲醇为色谱纯（德国Merck 公司，甲酸为色谱纯（美国Mreda 公司）；超纯水由Milli-Q 纯水机制备（美国Millipore 公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C18RRHT（2.1mm×50mm，1.8μm）；柱温：30℃；样品室温度：8℃；以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（程序为0～25 min，90%～55%B；25～40 min，55%～40%B）；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子化（ESI）正离子模式，干燥气温度为325℃，雾化气压力为35psi，毛细管出口电压为120V，干燥气流量为10 L·min-1，毛细管电压3.5 kV，质量扫描范围m/z 100～2 000，选择质荷比（m/z）为荭草苷449.107 8、异荭草苷449.107 8、牡荆苷433.112 9、木犀草苷449.107 8、木犀草素287.055 0、芹菜素271.055 9 离子进行检测。

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液 分别精密称取芹菜素、木犀草素、牡荆苷、荭草苷、异荭草苷、木犀草苷对照品适量，用甲醇溶解分别配制成198.80、200.40、202.80、203.40、201.00、200.60 μg·mL-1对照品储备液；精密量取上述对照品储备液各1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每毫升分别含上述成分19.88、20.04、20.28、20.34、20.10、20.06 μg混合对照品溶液，典型HPLC-QTOF 提取离子色谱图见图1。

2.3.2 供试品溶液 取本品（SP11）适量，粉碎，过60 目筛，精密称取0.25g，置5mL 连盖式离心管中，加入直径4.0mm 的不锈钢珠5 粒，精密加入甲醇2mL，密塞，置于高通量组织研磨仪中提取120 s（频率70 kHz），提取液离心10 min（转速15 000 r·min-1，离心力15 300×g），取上清液稀释1～6 倍，即得。

2.4 方法学验证

精密吸取上述对照品储备液适量，稀释成系列标准溶液（n=6），按上述色谱质谱条件进样，以各对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；分别以信噪比为3 和10 考察检测限（LOD）和定量限（LOQ）；取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，按上述色谱质谱条件连续进样6 次，记录峰面积，计算RSD 作进样精密度考察；取“2.3.2”项下的同一批供试品溶液（SP 11），分别在室温下放置0、3、6、12、18、24 h，按上述色谱质谱条件进样，记录峰面积，计算RSD 作稳定性考察；精密称取同一样品（SP 11）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱质谱述条件进样测定，计算样品含量和RSD，考察方法的重复性；取同一批样品（SP 11）6 份，每份约0.125 g，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密加入对照品适量，按上述色谱质谱条件进样，考察加样回收率。

由表1 可知，芹菜素、木犀草素、牡荆苷、荭草苷、异荭草苷、木犀草苷在较宽的浓度范围内均呈现良好的线性关系（r2均＞0.995 0）；LOD（S/N=3）和LOQ（S/N=10）的范围分别在0.20～0.27 μg·mL-1和0.40～0.82 μg·mL-1；由表2 显示，精密度试验RSD＜3.5%，方法重复性试验RSD＜4.0%，稳定性试验RSD＜3.5%，表明仪器精密度和方法重复性均良好，且样品在24 h 内稳定；6 种黄酮化合物的加样回收率为95.41%～105.82%，RSD 为2.03%～4.16%，表明本方法的回收率良好。

表1 6 种黄酮类成分的标准曲线、检测限和定量限

表2 6 种黄酮类成分的精密度、稳定性、重复性和回收率

2.5 样品含量测定及统计分析

利用上述色谱质谱条件对52 批浮萍样品中6个黄酮成分的含量进行测定，结果见表3。

表3 浮萍中6 种黄酮类成分含量测定结果（μg·g-1，n=2）

利用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics 公司）对52 批浮萍样品中6 个黄酮成分的含量数据进行多维变量统计分析，包括建立PCA、OPLS-DA、PCA-Class模型及分析等[2，3]。

所有样品含量的原始数据经UV 尺度化（Unit Variance Scaling）建立PCA 模型，经交叉验证后拟合的PCA 模型中有3 个主成分，R2X（cum）=0.958，Q2（cum）=0.713，可知模型能够很好地拟合浮萍中黄酮含量的原始信息，且有较好的预测能力，第一主成分的贡献率为61.2%，得分图见图2。样品无明显的异常点，青萍和紫萍大体上分为两类，且在第一主成分上有较大区分，在第二、第三主成分上无明显区别。从Biplot 图（图3）中可见，青萍样品与异荭草苷含量有较强的正相关；与芹菜素、木犀草素呈明显负相关；与荭草苷、木犀草苷、牡荆苷也呈一定的负相关。紫萍样品与芹菜素、木犀草素、荭草苷、木犀草苷、牡荆苷的含量呈正相关；而与异荭草苷呈负相关。这与表4 的含量测定结果是相一致的：所有青萍样品中均未检出芹菜素，木犀草素也仅在少数样品中检出，且含量很低。在31 批紫萍样品中，仅有4 批含有异荭草苷，且含量很低；而青萍中的异荭草苷和紫萍中的其它黄酮成分含量明显较高。

对紫萍和青萍间建立OPLS-DA 模型，经自动拟合后分别生成1 个预测主成分和1 个正交主成分，R2X（cum）=0.831，R2Y（cum）=0.748，Q2（cum）=0.738，对原始数据具有较好的解释度和预测度，得分图见图4。对上述模型作200 次排列实验，其R2Y与Q2Y 的截距分别为-0.013 5 和-0.196，说明该模型稳定，且不存在过拟合现象。

预测主成分显示了青萍和紫萍的组间差异，两组间存在较为明显的区别，说明两者的黄酮含量间存在差异；正交主成分显示了浮萍黄酮含量的组内差异，可见青萍样品的组内差异较小，黄酮含量彼此之间较为相似，而紫萍样品的组内差异较大，成分含量波动较大，有的甚至超过了组间差异。SP 15、SP 17、SP 19 三批紫萍样品的黄酮含量与青萍相似。

几种黄酮类成分对于模型中组间差异的重要性依次为木犀草素＞芹菜素＞木犀草苷＞牡荆苷＞荭草苷＞异牡荆苷，且各成分均有显著性差异（P＜0.05），各成分的回归系数也均有统计学意义（P＜0.05），且芹菜素的回归系数最大。对各成分之间的相关性进行分析，结果见表4。荭草苷和牡荆苷、木犀草苷和牡荆苷、荭草苷之间有很强的正相关关系，相关性均＞0.9。

3 讨论

3.1 提取条件的优化

本研究分别考察了不同溶剂（50%、70%甲醇，甲醇；50%、70%乙醇，乙醇）、不同提取方法（超声处理、研磨）、不同提取时间（超声20、30、40 min，研磨60、90、120、180 s）对样品的处理效果，结果表明，以甲醇为溶剂，超声处理30 min 及研磨120 s 以上，测得样品中各组分的含量较高，也无显著性差异，且研磨法可大大缩短提取时间，提高了效率，故确定最佳提取方法为：甲醇作溶剂，用研磨法，研磨120 s。

表4 浮萍中6 种黄酮类成分的相关性

3.2 检测方法的选择

对于黄酮类化合物的液相色谱法含量测定，目前采用紫外检测器[4-7]较多。本实验发现，对照品溶液的紫外色谱图中（350 nm），虽然6 个黄酮类待测组分均有较好的紫外吸收，且各成分在上述色谱条件下均能达到基线分离，但是在浮萍样品中，由于成分复杂且黄酮类成分含量较高，常存在共流出组分，且共流出组分也具有较强的紫外吸收，会对待测组分的定量测定产生严重的干扰。由图5-A 中可看到，青萍样品（LM 14）的紫外色谱图中木犀草苷（17.481 min）的位置仅有一个峰，且峰强度远高于对照品，但是在该出峰时间的质谱图中（图5-B）可明显看出含有两个成分，除了含有木犀草苷（m/z 449.1059）外，还含有m/z 433.1123 的成分，计算后木犀草苷实际浓度仅约为对照品的四分之一，故不能采用传统的紫外检测器对待测组分同时定量，而高分辨质谱检测器却能够在复杂的基质中精确检测待测成分，避免共流出组分的干扰，故本文采用液相色谱串联质谱法对6 个黄酮类组分进行定量检测。

3.3 色谱质谱条件的优化

本研究分别考察了不同的有机相（甲醇、乙腈）及洗脱条件（等度及不同梯度洗脱程序），结果表明，采用甲醇作为有机相及上述的梯度洗脱程序时，样品中的各待测组分之间及与其它成分能够相对较好的分离，减少共流出组分的干扰。对不同的毛细管出口电压进行考察时发现，当毛细管出口电压设置过高时，会增加待测组分在源内的裂解，从而降低化合物的质谱响应；而过低的毛细管出口电压又会导致离子传输效率的降低，也会降低化合物的质谱响应。优化的结果表明，当毛细管出口设置为120 V 时，各待测组分均能有较好的响应。

3.4 多变量统计分析与实验结果

本研究建立了高效液相色谱-串联高分辨质谱法同时测定浮萍中6 种成分的含量，克服了有紫外吸收的共流出组分时、采用传统的紫外检测器无法准确定量的问题，并对紫萍和青萍中的黄酮含量进行了多维变量统计分析，结果表明，紫萍和青萍中黄酮成分的含量存在较大差异；紫萍的组内差异较大，不同样品的黄酮含量波动较大；而青萍样品的组内差异较小，黄酮含量彼此之间较为相似。青萍中不含芹菜素，木犀草素也仅在少数样品中检出，且含量很低，与异荭草苷含量有较强的正相关，与芹菜素、木犀草素呈明显负相关，与荭草苷、木犀草苷、牡荆苷也呈一定的负相关；紫萍仅有少量样品含有异荭草苷，且含量很低，与芹菜素、木犀草素、荭草苷、木犀草苷、牡荆苷的含量呈正相关，而与异荭草苷呈负相关。荭草苷和牡荆苷、木犀草苷和牡荆苷、荭草苷之间的相关性均＞0.9。