血清Adropin蛋白和脑啡肽酶在2型糖尿病视网膜病变患者中的变化及影响因素

张校康，李宝新，李 娜，翟 娜，张云良，刘莉芳，王 翯，郭淑芹

0 引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一，随着病情的发展会逐渐影响人们的视力水平，也是不可逆性致盲最常见的病因。因此对DR的发生、发展机制及其影响因素的研究越来越引起人们的关注。有研究显示，DR的发生、发展不仅与血糖控制水平，而且与血管内皮功能有着密不可分的关系[1]。Adropin蛋白(AD)是新发现的一类生物活性蛋白，由 76 个氨基酸组成，具有调节能量代谢、改善血管内皮细胞功能的重要作用[2]。而且有研究显示，在糖尿病小鼠组血清中AD水平明显低于非糖尿病小鼠组，表明AD在糖尿病的发生、发展中有一定作用[3]。脑啡肽酶(neprilysin，NEP)是位于细胞表面的Ⅱ型膜蛋白，是含锌的金属肽酶，在机体中广泛存在，具有调节糖尿病患者血管内皮细胞功能的重要作用[4-5]。但是AD和NEP两个因子在DR的发生、发展中是否起一定作用，以及二者相互作用关系尚未明确。因此本研究旨在观察AD和NEP水平在不同程度DR患者血清中的变化并分析其影响因素，进而为研究DR的发生、发展机制提供理论依据。

1 对象和方法

1.1对象收集2017-10 /2019-01符合1999年WHO糖尿病诊断标准[6]并且于在保定市第一中心医院内分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者167例。所有受试对象均行散瞳，由2名有经验的医师行直接眼底镜和眼底荧光血管造影检查，根据临床DR严重程度的分级标准[7]，将患者分为单纯2型糖尿病组(DM组)59例，2型糖尿病合并视网膜病变组(DR组)108例，DR组包括非增殖期视网膜病变组(NPDR组)45例和增殖期糖尿病视网膜病组(PDR组)63例。另外选取于我院健康体检者57例作为正常对照组(NC组)。纳入标准：(1) 符合1999年WHO正常糖代谢、糖尿病和DR的诊断标准；(2) 能配合进行眼底检查；(3) 同期的健康体检者(符合正常糖代谢状态并且既往无其他基础病病史)。排除标准：(1) 糖尿病急性并发症(糖尿病酮症酸中毒，高血糖高渗状态)；(2) 眼外伤及由其他原因引起的视网膜病变；(3) DR患者已行全视网膜激光光凝术；(4) 合并严重心、脑及血液等系统疾病及肿瘤；(5) 合并严重肝肾功能异常；(6) 合并其他基础病。本研究获保定市第一中心医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法收集并记录所有研究对象的年龄(Age)、DM 病程，并测量其身高、体质量、收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)，计算体质量指数 (body mass index，BMI)，BMI=体质量/身高2(kg/m2)。所有研究对象均禁食8～10h后次日清晨采集空腹静脉血(FPG)，以4000r/min 离心5～7min。采用日立7600生化仪器检验空腹静脉血糖(fasting plasma glucose，FPG)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)采用糖化HA8180仪器检验糖化血红蛋白(hemoglobin Alc，HbA1c)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清AD(pg/mL)和NEP(U/L)水平，试剂盒购自上海酶联免疫生物有限公司(Elabscien)。根据试剂盒说明书的指示，AD的有效检测范围是12.5～400pg/mL，NEP的有效检测范围是6.25～200U/L。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，结合试验数据分析及试剂盒说明书显示，两因子批内变异系数均<10%，批间变异系数均<15%。

2 结果

2.1四组研究对象基本资料的比较四组研究对象的年龄、DBP比较差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比，DM组、NPDR组、PDR组的BMI显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。DM组、NPDR组、PDR组的DM病程差异无统计学意义(P>0.05)。与NC、DM组相比，NPDR、PDR组的SBP明显升高，PDR组明显高于NPDR组(P<0.05)，见表1。

2.2四组研究对象血清生化检查和相关指标的比较四组研究对象的TC、BUN、SCR、ALT、AST的差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组相比，DM组、NPDR组、PDR组的TG水平明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。四组间的FPG、HbA1c水平依次上升，均以PDR组最高，差异有统计学意义(P<0.05)，各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各组间NEP水平依次升高，以PDR组最高(P<0.05)，四组间的AD水平依次降低，其中以PDR组最低(P<0.05)，见表2。

表1 四组研究对象基本资料的比较

注：DM组：单纯2型糖尿病组；NPDR组：非增殖期视网膜病变组；PDR组：增殖期糖尿病视网膜病组；NC组：健康体检者。

表2 四组研究对象血清生化检查和相关指标的比较

注：DM组：单纯2型糖尿病组；NPDR组：非增殖期视网膜病变组；PDR组：增殖期糖尿病视网膜病组；NC组：健康体检者。

表3 AD、NEP与各指标间的Pearson的相关分析

2.3血清AD、NEP水平与各相关因素Pearson相关分析根据Pearson相关分析，血清AD水平与DM病程、SBP、DBP、BMI、TG、FPG、HbA1c、NEP呈负相关(P<0.05或P<0.01)。血清NEP水平与DM病程、SBP、BMI、TG、FPG、HbA1c呈正相关(P<0.05或P<0.01)，与AD呈负相关(P<0.01)，见表3。

2.4血清AD、NEP水平多元线性回归分析分别以AD、NEP为因变量，将Pearson相关分析后得出的差异有统计学意义的指标为自变量，行多元线性逐步回归分析，结果显示血清AD表达的显著影响因素为FPG、HbA1c和NEP(P<0.05)，显著影响NEP水平的因素为BMI、FPG、HbA1c和AD(P<0.05或P<0.01)，见表4、5。

3 讨论

糖尿病视网膜病变已经成为严重影响我国公共健康的主要疾病之一，随着DR的进展常常造成视力下降、视野缺损、玻璃体积血等损害，严重者甚至出现牵拉性视网膜脱离最终导致失明[8-10]。因此对于DR的早期诊断和干预越来越成为临床医学的研究热点。本研究旨在以不同分期DR患者为主要研究对象，观察血清AD和NEP水平在不同分期DR患者中的变化并分析其影响因素，为探究2型糖尿病视网膜病变的发生机制提供数据支持。

AD是一种由能量平衡相关基因(enho)编码的调节蛋白，在肝脏和大脑中广泛表达。有研究显示，AD可以通过影响磷脂酰肌醇3-激酶-Akt和细胞外信号调节激酶这两个通路，从而上调内皮NO合成酶的表达，进而增加上皮细胞NO的浓度起到血管内皮的保护作用[9]。不仅如此，有动物实验显示AD能显著增加小鼠后肢缺血模型的血流量和毛细血管密度，从而改善机体缺血、缺氧状态[11]。同时有研究显示，AD还可通过降低促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的mRNA表达，减少炎性因子的合成降低血液中炎性因子的浓度，从而减轻内皮细胞和单核细胞源性巨噬细胞的炎症反应[12]。众所周知，代谢的失衡、机体的炎症反应、内皮细胞功能障碍、血管通透性增加和新生血管的生成是糖尿病微血管并发症的基本过程，同时也是DR(尤其是PDR)的主要发病机制。上述研究显示，AD在抑制炎症反应和改善血管内皮功能有重要作用，因此我们不难推测AD可能对DR的发生和发展也有一定作用。一项观察不同病程糖尿病患者血清AD水平的研究发现，2型糖尿病患者血清AD水平明显低于正常对照组，并且随着糖尿病病程的延长，AD水平逐渐降低[13]，与本研究测定结果一致。同时本研究进一步探究了不同时期DR患者血清中AD水平的变化，并分析其影响因素，发现随着DR程度的加深血清AD水平逐渐减低，其中以PDR组最低，而且AD水平受到FPG、HbA1c及NEP的负向调节，表明AD水平对DR的发生、发展起负相关作用。而且另外一项研究发现，与DM组相比，PDR组和NPDR组患者血清和玻璃体中AD浓度明显降低，并且以PDR组最低，表明血清和玻璃体中AD水平与DR进程呈负相关[14]。不仅如此，本次研究的Pearson的相关分析还显示，年龄的增长、肥胖、长期血糖控制不佳和高血脂等因素都可能影响AD的水平。排除其他影响因素后分析得出，FPG、HbA1c、NEP是影响AD水平的独立影响因素，而且NEP与AD呈明显的负相关关系，表明二者有相互调节的关系，同时在DR的发生与发展中起一定作用。

表4 血清AD水平影响因素的多元线性回归分析

表5 血清NEP水平影响因素的多元线性回归分析

NEP是一种位于细胞表面依赖锌离子的Ⅱ型膜蛋白，在心脑血管和其他组织中广泛存在[15]。有研究表明，NEP主要通过降解或灭活许多生物活性肽，包括P物质、内皮素和心房利钠肽等，从而影响血管内皮的功能[16]。而糖尿病患者血管内皮功能的改变、新生血管的生成、血管收缩缺氧导致的炎症反应均为DR发生和发展的重要作用机制。另外有研究显示，可以通过NEP 抑制剂的作用，增加机体利钠肽的生物利用度，进一步对机体血管内皮功能起到调节作用[17-18]。而且在一项动物实验中显示，与对照组小鼠相比，通过NEP抑制剂处理过的小鼠整体血糖控制水平明显改善，糖尿病的进程明显减慢[19]。而且长期的血糖控制不佳和糖尿病病程的延长也是DR发生发展的重要因素，故我们可以推测NEP水平与DR的进展程度有相关性。一项临床研究显示，与正常对照组相比，2型糖尿病患者血清中NEP水平明显升高，而且随着糖尿病病程的延长，NEP水平逐渐升高，表明NEP水平与糖尿病的发生有关。本研究以正常受试者为对照组，测定血清NEP水平的变化，结果显示DM组患者血清NEP水平明显高于NC组，与上述研究结果一致，同时本研究进一步按照视网膜病变程度进行分组，发现随着DR程度的加深，血清NEP水平逐渐升高以PDR组最高，提示NEP水平可能与DR的发生、发展有着密切的联系。同时Pearson相关分析与多元线性回归分析显示，BMI、FPG、HbA1c、AD均为NEP水平的重要影响因素，表明NEP可能通过调节血糖的控制水平，调节机体代谢等作用与AD共同调节DR的发生和进展。

综上所述，我们通过本次研究发现，随着DR严重程度的进展，血清AD水平逐渐降低，NEP水平则逐渐升高，并且二者为负相关关系，表明AD和NEP可能通过不同的作用机制，以相反的作用方式来参与到DR发生和发展中，为以后进一步探究DR的发生机制提供了数据支持和理论依据。然而对于AD和NEP二者间具体的相互作用机制尚未明确，今后将进一步完善相关的基础研究，进一步探讨AD和NEP的相互影响机制。