基于SSR标记的华北落叶松种子园遗传多样性和交配系统研究

代剑峰，袁德水，张鸿景

（1.河北省林业和草原科学研究院，河北 石家庄050061；2.河北省林木良种工程技术研究中心，河北 石家庄050061；3.河北省木兰围场国有林场，河北 围场068450）

华北落叶松属松科落叶松亚科落叶松属植物，原产于河北、山西两省，为我国特有树种[1]。华北落叶松生长速度快、木材材质好、用途广、抗腐朽力强，是华北地区高山林带的主要造林和生态树种。华北落叶松育种主要是通过种子园来实现的，种子园在林木良种化的过程中发挥着重要作用[2]，不仅是提供大量优质种子的繁殖基地，本身又是由低级向高级发展的育种系统中的一个重要环节[3]。位于河北省承德市围场县的龙头山国有林场查字良种基地是现有的国家级落叶松良种基地之一，建有大面积的种子园，是河北省华北落叶松良种的主要来源。

种子园育种群体的遗传多样性和交配系统对种子园的长远发展具有重要意义。育种群体的遗传多样性影响着种子园良种的繁育能力和对生态系统的适应能力[4]，在良种选育过程中为了使种子园群体维持较宽的遗传基础，必须首先研究种子园的遗传多样性水平。另一方面，种子园交配系统不仅影响育种群体的遗传变异水平[5-6]，同时还决定着后代基因型的空间分布和进化潜能[7-10]，对种子园长远发展、种子产量和质量起着至关重要的作用。异交率和近交指数是交配系统的特征参数，直接反映了育种群体发生近交的概率，近交会导致杂合子比例下降、近交衰退和有效种群大小下降[11-12]，对种子园的育种效率产生不利影响。因此，在了解种子园各群体的遗传多样性水平的同时掌握种子园交配系统的实际情况，不仅对种子园的遗传管理与经营有着极其重要的生产实践意义，而且对林木遗传育种方法的选择具有指导意义。

近年来在国内针叶树种中红松、马尾松和油松等都已相继开展了天然林以及种子园遗传多样性和交配系统的研究[13-14]，而针对华北落叶松种子园交配系统的研究至今未见报道。随着各种分子标记技术的不断发展，对交配系统的研究更加精确、方便，其中SSR分子标记是目前应用最为广泛的技术手段之一[15]。本文以围场县龙头山国有林场查字良种基地的华北落叶松1.5代种子园37个无性系及其193个子代为样本，利用9对SSR引物并结合毛细管电泳检测方法，分析了该种子园的遗传多样性和交配系统，为华北落叶松高世代种子园建设提供理论指导。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

取样地点位于河北省承德市围场县龙头山国有林场查字良种基地的华北落叶松1.5代种子园，以其中37个优良无性系为亲本群体，从子代林中随机选择这37个亲本对应的4~7个子代单株，共193株，作为子代群体，于2018年5月上旬取针叶样本，置于-20℃备用。

1.2 DNA提取和SSR-PCR扩增

采用CTAB法提取亲本和子代群体总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度和质量后-20℃储存备用。

选用9对结果清晰的多态性引物进行PCR扩增（表1），PCR采用25μL体系，其中2μl基因组DNA，12.5μL 2×Taq Mix（＋Dye），4μL 10μmol/L的上下游引物（上游引物加入M13标签）和0.5μL 1μmol/L M13修饰的荧光标签（M13-FAM、M13-HEX、M13-ROX和M13-TAMRA）。PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，65℃（-0.5℃每循环）45s，72℃1min（20个循环）；94℃30s，55℃45s，72℃1min（15个循环），72℃10min。扩增产物在ABI 3730XL DNA测序仪上进行长度多态性检测。

表1 引物信息

1.3 数据分析

使用GeneMarker V2.4.0对检测结果的峰图进行读取，记录等位基因信息，然后利用GenAlEx6.5估算亲本和子代群体的遗传多样性参数，包括等位基因数（Na）、有效等位基因数（He）、Shannon’s信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和固定指数（F=1-Ho/He）[16]；采用MLTR 3.4软件对交配系统参数进行评估。采用最大期望值法，在95%的置信区间下经过1000次重复取样估算多位点异交率（tm）、单位点异交率（ts）、双亲近交系数（tm-ts）及单位点父本相关性（rp(s)）和多位点父本相关性（rp(m)）[17]等。

2 结果与分析

2.1 华北落叶松亲本群体遗传多样性

亲本群体37个无性系在9个SSR位点上的基因分型结果显示（表2）：在亲本群体中共检测到93个等位基因（Na），平均每个位点10.33个，平均有效等位基因数（Ne）为5.137，其中LD75位点的Na和Ne最大，分别为15和9.447，LD06最小，分别为4和2.073；亲本群体的Shannon’s多样性指数（I）为1.795；观测杂合度（Ho）的均值为0.346，小于期望杂合度（He）0.748，表明有杂合子缺失。图1为引物LD67在部分母本和子代中的扩增结果。

2.2 华北落叶松子代群体遗传多样性

子代群体在9个SSR位点上的基因分型结果显示（表3）：在子代群体中共检测到127个等位基因（Na），平均每个位点14.11个，较亲本群体高出3.78个；平均有效等位基因数（Ne）为6.075，较亲本群体高出0.938个；子代群体的Shannon’s多样性指数（I）为2.034，略高于亲本，说明子代不仅保持了亲本的遗传多样性，还受到了其他种子园亲本基因流的影响；观测杂合度（Ho）的均值为0.424，略高于亲本群体，期望杂合度（He）的均值为0.791，与亲本群体基本一致，表明子代群体中观测到的杂合子比例有所上升，但依然存在杂合子缺失的现象。

表2 华北落叶种子园亲本群体9个位点的群体遗传学参数

图1 引物LD67在部分母本和子代中的扩增结果

表3 华北落叶种子园子代群体9个位点的群体遗传学参数

2.3 华北落叶松种子园交配系统分析

利用MLTR程序对华北落叶松1.5代种子园37个母本单株的193个子代进行分析（表4），9个位点估算出多位点异交率（tm）为0.829，而单位点异交率（ts）较低为0.465。种子园存在较明显的双亲近交现象，双亲近交系数（tm-ts）为0.364。单位点父本相关性和多位点父本相关性分别为0.526和0.485，两者的差值（rp(s)-rp(m)）反映双亲关联度与交配群体结构之间的关系，本种子园的rp(s)-rp(m)为0.041，表明有部分花粉供体的亲缘关系较近。

表4 华北落叶松种子园交配系统参数

3 讨论与结论

本研究中亲本和子代群体都表现出了较高的遗传多样性，期望杂合度分别为0.748和0.791，它们的Shannon’s多样性指数分别达到了1.795和2.034，远高于同类研究的检测结果（0.713~0.846）[4，18]。这可能与使用的SSR引物不同且数量较少有关。另外，在早先的研究中，位点多态性数据是通过读取非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的条带信息得到的，而本研究的结果是通过ABI 3730XL DNA测序平台读取的，后者分辨率可高达1%，能以2~4bp的分辨率高效区分20~20000bp DNA片段，在200bp处，可清楚分辨2bp差异的条带，因此能够获得更为丰富的位点多态性数据，最终得到的有效等位基因数也远高于前者。

子代群体与亲本群体的遗传多样性差异不大，甚至略高于亲本，子代群体等位基因数有明显上升，表明虽然种子园各小区间有樟子松或云杉作为隔离带，但参试的1.5代园亲本群体依然接收到了其他小区亲本的花粉。亲子代间各位点占主导地位的等位基因频率并没有显著差异，固定指数F基本一致，表明亲子代的杂合子水平没有发生明显变化。证明在连续的上下2个世代间遗传结构没有发生显著变化[19]。

针叶树多为风媒传粉，其天然群体或人工群体的异交率大多在90%上下波动[19-20]，本研究中华北落叶松育种群体的多位点异交率为0.829（0.044），与早年在华北落叶松天然群体的检测结果基本一致（0.792~0.847）[21]，但单位点异交率较低。近交指数达到了0.364，这个检测结果远高于其他以异交为主的树种，如：马尾松（-0.031~0.004）[22-23]、红松（0.027）[24]、翅果油树（0.086）[25]以及木荷（0.061）[26]等，该结果表明种子园存在明显的近亲交配现象。这可能与亲本的来源有关，1.5代园母树主要来自于河北省华北落叶松天然林分中的优良单株，而华北落叶松天然林在整个华北地区的遗传分化较小[27]，因此，很容易导致亲本群体的亲缘关系较近，甚至母树本身就是近亲交配的后代。

华北落叶松1.5代种子园育种群体的遗传多样性较丰富，子代群体也能够很好的保持亲本的高遗传多样性，表明该种子园具备良好的育种潜力。但是作为异交为主的针叶树种，华北落叶松种子园却出现了明显的近亲交配现象，同时还观测到了杂合子缺失的情况，这对于种子园的长久发展会产生不利影响。在后续建设高世代种子园时应采取一些必要的措施，如：亲本筛选、控制授粉、引种和种间杂交等，尽量减小近亲交配的可能，从而避免近交造成的不良影响。

因为受限制于筛选出的SSR引物数量，本研究的结果都是基于9个位点的群体遗传学参数进行分析和讨论的，较少的位点信息可能会导致结果出现部分偏差，在下一步的研究工作中将尝试筛选出更多的引物来加强结果的可信度。