腺嘌呤诱导肾性骨病大鼠模型的生物力学分析

孟 彦 贺 宁 马 岚 潘 雪 韩 霞 赵建荣 武素珍 左 力

2010年全世界范围慢性肾脏病(CKD)的患病率在20岁以上男性为10.4%,女性为 11.8%[1];在我国,2012年统计CKD 的患病率约为10.8%,总人数约1.195 亿[2]。1990年～2016年全球CKD发病率增加了89%,患病率增加了87%[3]。早在CKD 3期,由于肾功能下降,开始逐步出现肾脏排磷功能下降,钙、磷调节激素代谢异常,导致进行性加重的骨及矿物质代谢紊乱,即慢性肾脏病矿物质和骨异常(CKD-MBD)。在CKD 3～5期,大多数患者会出现肾性骨病,表现为骨质疏松、骨痛、骨折等,显著增加了患者的痛苦及社会经济负担。2014年发表的研究提示,血液透析患者骨折的发生率较普通人群增加3.7倍[4]。

我们在前期工作中利用含有腺嘌呤的高磷饮食成功建立了腺嘌呤诱导的大鼠肾性骨病模型[5],通过骨形态计量学的方法,发现该模型较好模拟了人类肾性骨病中的纤维性骨炎这一病理类型。但是,前期研究未评估该模型生物力学效应。生物力学是代谢性骨病研究中的重要评估手段[6-7],从结构力学和材料力学的角度对骨质量进行评估,直接反映骨骼的质量。本研究利用腺嘌呤诱导的肾性骨病大鼠模型,以生物力学的方法作为主要检测手段,评估腺嘌呤诱导的大鼠CKD肾性骨病模型的生物力学性能。

材料与方法

实验动物雄性11周龄SPF级SD大鼠共20只(体重420±32g)购买自北京维通利华公司。大鼠饲养在北京大学医学部实验动物中心,相对湿度60%～70%,环境温度23%±2 ℃,光照12 h/12 h明暗交替,每一笼4只,按照“3R”原则进行照护。

材料课题组确定动物饲料配方,委托北京科澳协力饲料公司进行加工。饲料配方基于AIN-93纯化饲料配方[8]进行调整。共定制两种饲料,第一种加入0.75%腺嘌呤,第二种无腺嘌呤。其他成分两种饲料一致,均含磷1.03%,钙1.11%,酪蛋白9%。

动物实验方案经过2周的环境适应后,大鼠被随机分成两组:(1)正常对照组,用不含腺嘌呤的饲料喂养,共6周;(2)CKD组,前4周用含有0.75%腺嘌呤的饲料喂养,后2周用不含腺嘌呤的饲料喂养。6周后,处死所有大鼠。留取血标本备血清生化标志物检测。取材第五腰椎和双侧股骨,第五腰椎和左侧股骨行骨密度(BMD)测试,右下肢股骨用来行生物力学测试。

血清标志物检测血尿素氮、血清肌酐(SCr)、血清钙及无机磷由日立 7600自动生化分析仪(HITACHI,Japan)检测。血清甲状旁腺激素(PTH)水平采用大鼠全段PTH ELISA试剂盒(Immutopics,USA) 检测。

BMD检测用QDR-Discovery型骨密度仪(Hologic,USA)进行离体骨BMD检测。检测全股骨平均BMD和第五腰椎椎体的BMD。

骨生物力学测试选择第五腰椎椎体进行腰椎压缩试验,选择右侧股骨行三点弯曲试验。第五腰椎椎弓在检测前被去除,在测试前椎体上下两面的软骨和皮质骨由砂纸磨去,暴露松质骨。使用MTS力学测试机(MTS,USA)将股骨压缩至断裂或将椎体压缩至出现压缩骨折,描记载荷-变形曲线。将测试室温度设置为25℃,相对湿度50%～60%,设定加载速度3 mm/min,设定三点弯曲试验的跨距18 mm。结构力学指标选取最大桡度(Maximum displacement)、最大载荷(Maximum load)、刚度(Stiffness)和载荷能量(Force energy),材料力学指标选取最大应变(Maximum strain)、最大应力(Maximum stress)、弹性模量(Elastic modulus)和韧性(Toughness)。骨骼标本的处理方式、生物力学计算公式的确定主要参考Sato等[9]的研究。上述工作在北京大学第三医院骨科实验室完成。

统计分析统计分析由《SPSS 24》统计软件完成。用均数±标准差表示计量资料。两组组间比较如果符合参数检验的要求,用两样本t检验;如果不满足参数检验的要求,用两独立样本Mann-Whitney U检验。采用连续测量方差分析进行体重变化情况的统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

体重及血清标志物检测结果两组大鼠在进入实验时体重无差异,随着时间推移,正常对照组体重逐渐上升,CKD组体重逐渐下降(表1)。整个饲养过程中两组均无大鼠死亡。两组大鼠处死时SCr、尿素氮、血钙、血磷、血PTH均有显著差异。

表1 第六周末大鼠体重及血清生化标志物数据

PTH：甲状旁腺激素；*：与正常对照组比较，P<0.05;**：与正常对照组比较，P<0.01;***：与正常对照组比较，P<0.001

BMD检测与正常对照组比较,第6周末,CKD组的股骨和腰椎BMD均明显降低(图1)。

图1 BMD测量结果

骨生物力学测量各组大鼠三点弯曲试验结构力学方面结果见图2,与正常对照组比较,CKD组的最大载荷(189.21±15.77 Nvs110.63±32.41 N,P<0.001)、最大桡度(0.85±0.19 mmvs0.60±0.20 mm,P<0.05)、刚度(499.17±47.49 N/mmvs303.52±94.35 N/mm,P<0.001)和载荷能量(117.61±30.90 mJvs47.25±22.63 mJ,P<0.001)均明显下降。

图2 第6周末大鼠股骨三点弯曲实验结构力学指标

各组大鼠三点弯曲试验材料力学方面结果见图3,与正常对照组比较,CKD组的最大应力(0.14±0.01 MPavs0.07±0.04 MPa,P<0.001)、最大应变(79 774.15±16 834.76vs55 393.29±19 413.84,P<0.05)、弹性模量(6.82±0.38 GPavs4.38±1.00 GPa,P<0.01)和韧性(8 196.81±2 068.64 MJ/m3vs3 442.13±1 754.36 MJ/m3,P<0.001)均明显下降。

各组大鼠腰椎压缩试验结果见图4。结构力学方面,与正常对照组比较,CKD组的最大载荷(247.65±30.32 Nvs186.41±37.52 N,P<0.01)、最大桡度(0.22±0.04 mmvs0.15±0.03 mm,P<0.01)和刚度(1 831.70±155.56 N/mmvs1 365.26±183.90 N/mm,P<0.01)和载荷能量(34.36 ±12.16 mJvs13.17±5.09 mJ,P<0.01)均明显下降。材料力学方面,与正常对照组比较,CKD组的最大应力(22.24±4.37 MPavs16.65±3.44 MPa,P<0.05)、最大应变(0.05±0.02vs0.03±0.01,P<0.01)、弹性模量(722.96±68.64 MPavs488.89±146.40 MPa,P<0.01)和韧性(0.55±0.24 MJ/m3vs0.22±0.08 MJ/m3,P<0.01)均明显下降。

图3 第6周末大鼠股骨三点弯曲实验材料力学指标

图4 第6周末大鼠腰椎压缩试验骨生物力学参数

讨 论

骨生物力学是生物力学的一个分支,其以工程力学的理论为基础,研究骨组织在外力作用下的力学特征和生物学效应,是对骨质量进行评估的一种可靠方法[10]。骨生物力学从结构力学和材料力学两个角度评估骨骼的质量,结构力学研究骨结构在外来因素作用下的强度、刚度和稳定性,材料力学研究骨结构中材料的强度和构件承载力、刚度、稳定性。目前动物水平评估骨质量的其他常用方法还有骨密度、显微CT(micro-CT)、骨形态计量学等方法。骨密度是利用影像学的方法测量单位面积下的矿化骨的含量,间接反映骨质量;micro-CT同样是利用影像学的方法对骨骼进行评估,较骨密度检查更加精细,可测量单位体积内的骨小梁含量、骨小梁厚度、骨小梁数目等静态指标。骨形态计量学是定量的骨病理学检查,可利用特殊的图像分析软件对普通光镜下骨病理图片进行定量分析,计算出骨小梁含量、骨小梁厚度、骨小梁数目等参数,同时观察成骨细胞、破骨细胞、骨矿化的情况,得出相应的参数,还可利用荧光显微镜从荧光素标记的骨骼病理图片中获得骨形成的动态参数,以此从骨量、骨矿化、骨转运三个角度较全面的评估骨骼的情况。然而,上述方法都是从间接的角度评估骨质量,有时会出现评估结果和实际骨质量不相符的情况。很多临床研究和动物实验都表明,影像学提示的矿化骨含量的增加,并不代表骨质量的增加,反而骨质量可能会下降,这在长期应用双磷酸盐的患者中尤为突出[11]。因此,对骨骼进行生物力学的分析就显得尤为重要。

本研究主要从生物力学的角度对腺嘌呤诱导的大鼠CKD肾性骨病模型进行评估。作者在前期研究中,已通过骨密度和骨形态计量学对该模型进行过研究,发现模型的特点较符合肾性骨病中的高转运类型纤维性骨炎的特点[5],可作为后续开展相关研究的载体,但是前期研究中缺乏骨生物力学的评估数据,本研究进行了良好的补充。

三点弯曲实验反映的是皮质骨的生物力学性能。从图2和图3股骨三点弯曲实验结果看,较正常对照组,CKD组大鼠股骨的结构力学性能和材料力学性能明显下降。这与图1提示的CKD组股骨骨密度下降结果一致,也与我们前期研究中骨形态计量学检测结果中的CKD组股骨皮质骨骨量下降、侵蚀小孔面积增加一致[5]。腰椎压缩实验体现的是松质骨生物力学性能。由图4的腰椎压缩实验的结果看,较正常对照组,CKD组大鼠腰椎松质骨的结构力学性能和材料力学性能有明显下降。这与图1提示的CKD组腰椎椎体骨密度下降结果一致,也与我们前期研究中骨形态计量学检测结果中的CKD组股骨松质骨骨量下降、骨矿化减弱一致[5]。目前尚无其他研究者关于该方面的研究报告。

小结：从生物力学的角度分析,临床上CKD时出现的高转运肾性骨病可被腺嘌呤诱导的大鼠CKD模型较好地模拟,表现为皮质骨和松质骨材料力学和结构力学性能的下降。结合作者前期的骨密度及骨形态计量学检测结果,未来开展CKD高转运肾性骨病的研究可采用腺嘌呤诱导的大鼠CKD肾性骨病模型作为研究载体。