食品中亚硝胺类化合物分析技术研究进展

孔祥一， 林 鹏， 方恩华， 庄丽丽，郑子龙， 徐敦明*

(1.厦门海关技术中心，福建厦门 361026；2.集美大学水产学院，福建厦门 361021；3.福建省市场监督管理局，福建福州 350003)

N-亚硝胺化合物是N-亚硝基化合物家族的一个重要角色，根据结构的不同可将亚硝胺化合物分为亚硝胺类和亚硝酰胺类，自然条件下亚硝酰胺易于分解，而亚硝胺则因其较为稳定且具有生物毒性而被人们重点研究。N-亚硝胺广泛存在于食品、化妆品和烟草等中，对生物有较强的致癌性。近年来，对N-亚硝胺类化合物分析方法研究已经成为食品安全领域的一个研究热点。目前关于亚硝胺的综述侧重于亚硝胺的阻断合成和消除，本文重点针对近几年国内外食品中N-亚硝胺类化合物分析技术进行系统综述。

1 N-亚硝胺类化合物的种类

1937年，Freund[1]首次报道了两例由于职业接触N-亚硝基二甲胺(NDMA)而导致中毒的案例，人们开始意识到亚硝基化合物的毒性，Barnes和Magee等[2]于1956年的研究成果再次证实了NDMA的肝毒性。现在人们已经发现300多种N-亚硝基化合物，可对40多种动物引发癌症。目前已发现了N-二甲基亚硝胺(N-Nitrosodimethylamine,NDMA)，N-甲基乙基亚硝胺(N-Nitrosomethylethylamine,NMEA)，N-二乙基亚硝胺(N-Nitrosodiethylamine,NDEA)，N-二丙基亚硝胺(N-Nitrosodi-n-propylamine,NDPA)，N-二丁基亚硝胺(N-Nitrosodi-n-butylamine,NDBA)，N-亚硝基三苯胺(N-Nitrosodiphenylamine,NDPhA)，N-亚硝基吡咯烷(N-Nitrosopyrrolidine,NPyr)，N-亚硝基吗啉(N-Nitrosomorpholine,NMorPh)，N-亚硝基哌啶(N-Nitrosopiperidine,NPIP)9种常见的亚硝胺类有毒物质。

2 N-亚硝胺类化合物的危害

N-亚硝胺对人体有很强的基因毒性，几乎可以对所有的器官和组织诱发癌症，其中主要是食管、肝脏和肾脏[3]。N-亚硝基中毒性最强的是NDMA和NDEA，在1978年国际癌症研究机构(IARC)把NDMA、NDEA评定为2A级致癌物[4]。在NDEA的动物急性毒性实验中,大鼠半数致死量为24～40 mg/kg体重，解剖发现肝组织严重破坏[5,6]。NPyr能够将gpt delta转基因大鼠肝脏中的碱基A突变为碱基G，从而诱发肝癌；根据研究推测NDMA的致死量为儿童300 mg，成人1 200 mg，至今未发现有动物可抵抗亚硝胺的致癌作用[7]。通过模拟人类对食品和饮料中的NDMA的暴露实验，预测美国和加拿大的上限癌症风险为一百万人口，因饮用水中终生接触NDMA而发生大约0.5(0～10.8)例癌症事件，终生接触主要外源性NDMA可能导致49.6例癌症事件[8]，其中肉类产品贡献最多(15.9/百万)，其次是奶制品(10.9/百万)[9]。文献曾报道了N-亚硝基化合物致癌等级[10]。蛋白质腐败分解的时候可产生胺类物质[11]，所以蛋白质含量丰富且易腐烂的食品往往有亚硝胺超标的风险，例如啤酒、水产品及腌制品，肉制品和水产品富含蛋白质，且蛋白质的分解产物可与亚硝酸钠进一步反应生成亚硝胺类化合物[12,13]，故肉制品和水产品往往是亚硝胺含量检测的重点[14,15]。

3 食品中N-亚硝胺化合物分析技术

含有N-亚硝胺化合物的样品繁多，包括气态、液态和固态样品，因此需要对不同检测样品开发不同的前处理技术和分析技术[16]。N-亚硝胺化合物的分析过程包括提取、分离、净化以及测定、确证等步骤，其中在食物样品中N-亚硝胺的含量一般在ppb级别，且通常响应较低，很容易被其他成分所干扰[17]，因此在检测前必须先解决基质对检测物质的影响，对样品中的亚硝胺进行分离富集[18]。

3.1 样品制备技术

3.1.1 固相萃取固相萃取(SPE)是目前亚硝胺化合物萃取分离使用最普遍的技术[19]，常用于水样的有效填料主要包括Ambersorb 572[20]、RP-C18[21]、LiChrolut EN[22]、硅藻土Extrelut[23]、coconut charcoal[24]等。Ballesteros等[25]比较不同填料对亚硝胺的吸附效果，结果显示LiChrolut EN和Ambersorb 572吸附效果较高；Qian等通过乙烯基-二乙烯基苯聚合物来对样品进行萃取，同时联合高效液相色谱-串联质谱法检测饮用水中亚硝胺，检出限为0.01～2.7 ng/L[26]；翟孟婷等[27]建立了碱液处理-活性炭柱固相萃取结合气相色谱-串联质谱联用检测鱼干、虾皮中亚硝胺，检出限为0.03～0.25 μg/kg；王宗义等[28]采用水蒸汽蒸馏-活性炭柱固相萃取火腿中的亚硝胺，NDMA和NMEA检出限≤0.1 ng/g；姚瑞雄[29]应用分散固相萃取技术和同位素稀释技术，结合气相色谱-质谱法(GC-MS)测定酱油中亚硝胺，检出限为0.5～1.0 μg/kg；谢爱萍等[30]利用碳纳米管对饮用水中的亚硝胺进行萃取，当取水量为250 mL时定量限为4.0 μg/L，检出限为1.0 μg/L；Plnans等[31]对比了椰壳活性炭、Li Chrolut EN、Ambersorb 572的组合材料吸附NDMA的效果，其中椰壳活性炭的回收率为88%远高于其他材料。固相萃取法污染小且对样品选择性吸附效果好，成为萃取分离亚硝胺最为广泛的技术。

3.1.2 固相微萃取技术固相微萃取(SPME)是20世纪90年代兴起的样品前处理与富集技术，由Pawliszyn[19]首次进行开发研究，该技术是利用石英纤维表面对分析组分的吸附作用从而萃取出组分并富集，在进样过程中流动相在高温条件下将吸附的组分解吸下来并由色谱仪进行分析[32,33]。Grebel等[34]将SPME技术和氮化学发光仪(NCD)、氮磷检测器(NPD)和质谱等进行联用，发现具有较高的回收率和较低的检测限，是可行的低成本检测N-亚硝基化合物的技术，但SPME-NPD法的基质效应明显无法检出NPIP；Lashgar等[35]通过氧化对碳质进行处理，并连接不同的羧基以在碳质吸附剂的惰性表面上产生亲水/疏水平衡，从水样中提取亚硝胺时提取率显著增强;Yamini等[36]将吸附剂在甲醇中超声处理后再注入GC-MS/MS进行分析，检测限低于3 ng/L。固相微萃取不用溶剂进行解吸，相比于固相萃取速度更快，受到越来越多的相关人员的关注。

3.1.3 超临界萃取超临界萃取因其具有环保、快速、无副反应、自动化程度高等优点而被广泛使用[37]，CO2是最常使用的萃取剂。Jose等[38]发现增加甲醇的加入量可以增加流体的极性从而实现亚硝胺的更好的回收，但当甲醇的添加量超过10%则回收率开始下降；Sanches等[39]使用CO2超临界流体萃取(SFE)和胶束电动色谱法(MEKC)测定香肠中亚硝胺含量，通过对密度、顶针温度、萃取时间、改性剂、流体流动和捕集阱种类等参数的优化，确立了提取的最佳条件是在20 min内使用动态提取，并在捕集器中使用Florisil吸附剂，并用甲醇洗脱分析物。

3.1.4 液-液萃取在中性或碱性溶液中N-亚硝胺化合物溶解度一般较小，而在醚类、醇类以及二氯甲烷等有机溶剂溶解度很大，故可以使用极性有机溶剂来提取N-亚硝基化合物[40]，在提取过程中加入NaCl、K2CO3或Na2CO3来减少亚硝胺分子周围的水分子从而增加有机溶剂的分子相互作用，从而得到更高的萃取效率。张桃芝等[41]运用一滴溶剂萃取-气相色谱(SDE-GC)联用技术检测啤酒中的亚硝胺；Sagratini等[42]使用乙腈、甲苯和氯甲酸异丁酯混合作提取试剂，通过分散液液微萃取-气相色谱-质谱法测定啤酒中亚硝胺，均可达到很好的效果。

3.1.5 蒸馏法肉、鱼及其加工腌制品通常富含较多的蛋白质和脂肪，在碱性溶液中很容易发生皂化反应而产生大量泡沫，通常使反应在中性或碱性的环境下蒸馏而使泡沫分离，这样不仅不会使反应的前身物质形成新的N-亚硝胺化合物，同时还可以去除大部分的亚硝酸盐和酸性杂质[43]。国家标准(GB 5009.26-2006)[44]使用水蒸汽蒸馏法来分离亚硝胺，但普遍反应回收率偏低且定量不够准确。

3.1.6 超声波萃取Yuan等[45]使用超声波溶剂萃取-气相色谱-质谱法测定肉制品中的挥发性亚硝胺，仪器检测限和仪器定量限分别为1.134～9.894 μg/L和3.779～32.980 μg/L，方法的检测限和定量限分别为0.057～0.495 μg/kg和0.189～1.649 μg/kg，方法回收率为82.575%～108.364%。超声波萃取法的操作过程简单温和，萃取快捷且效率较高。

3.1.7 微波辅助萃取Ramezani等[46]使用微波辅助萃取-分散液液萃取-气相色谱-质谱法测定香肠中亚硝胺，亚硝胺回收率在83.9%～109.4%之间，检测限和定量限分别为0.11～0.48、0.41～1.45 μg/g，该方法可减少样品基质干扰。Campillo等[47]使用该技术测定肉制品中挥发性亚硝胺的含量，NPIP和NMEA的检出限均为0.003～0.014 ng/mL。

3.1.8 QuEChERS法QuEChERS法具有操作简单、方便快捷、经济环保等特点。高蕙文等[48]将样品通过QuEChERS法处理后，使用气相色谱-串联质谱法检测，检出限为0.1 μg/kg，加标回收率在89.0%～117%之间。QuEChERS法回收率高检出限低，对样品的需求量小，适用于大批量样品的检测。

3.2 N-亚硝胺化合物的检测技术

3.2.1 气相色谱气相色谱(GC)可以使用多种检测器，如氢火焰检测器(FID)、氮磷检测器(NPD)、化学电离源质谱(CI-MS)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)[50]。

赵丽等[51]和李婷等[52]使用旋转蒸发仪和氮吹浓缩仪处理样品，并同时加入甲醇来加速挥发，结合气相色谱检测，标准物回收率提高了4%～12%；马俪珍等[53]采用气相色谱-火焰离子化法(GC-FID)检测熟肉制品中的亚硝胺物质，检出限达到了0.8 μg/mL，在此基础上杨宁等[54]使用Al2O3-C18双填料固相萃取法预处理，结合GC-FID法直接快速分析样品中亚硝胺，在一定程度上避免了交叉污染；LEDA等[55]采用二氯甲烷有机溶液对亚硝胺进行萃取，再使用GC-FID检测肉制品中的7中挥发性亚硝胺，检出限为0.077～0.180 μg/kg，回收率82.0%～105.5%；朱铭洪[56]通过吹扫捕集并经毛细管色谱柱分离，检测啤酒样品中亚硝胺灵敏度和准确度更高；Kocak等[57]将样品经两部固相萃取，然后用氮化学发光检测系统结合气相色谱分析，研究了经过烧烤后羊肉的亚硝胺含量变化，由0增加到4.51 μg/kg；Yurchenko等[58]将样品用外洗脱法和Florisil吸附法进行两步固相萃取，以氨气为试剂，用正离子模式进行检测，检出限和定量限分别为0.10、0.35 μg/kg。气相色谱法由于其技术简单经济成为挥发性亚硝胺类物质常用的检测技术之一。

3.2.2 气相色谱-质谱联用技术气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术是目前应用最广泛、公认最有效的检测技术之一[43]。陈海槟利用超声振荡提取亚硝胺后，用固相萃取柱和DB-WAX色谱柱检测腌制水产品中的的挥发性N-亚硝胺化合物[59]，通过对萃取柱、色谱柱、柱温升温速率等优化后NDPA检测限为0.03 μg/kg；余卫军等[60]使用QuEChERS技术对市售的腊肠用气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)进行检测，通过浓缩降低了检出限(0.01～0.10g/kg)；金璐等[61]采用气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测四川泡菜中7种亚硝胺物质，并测定3个泡菜样本中亚硝胺物质的含量，测得亚硝胺的平均含量在2 mg/kg以下，检出限为0.01～0.12 mg/kg，灵敏度较高；Andrade等[62]采用NaOH或甲醇萃取、固相萃取法提取出亚硝胺，测得定量限为0.3～0.4 mg/kg；Chen等[63]使用5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷毛细管柱联合GC-MS/MS法对NPIP和NDBA检测，实现了更高选择性和灵敏度；周再春等[64]使用质谱双探针法，将电子轰击离子源轰击亚硝胺化合物时产生的NO和N2O作为探针信号来跟踪亚硝胺，大幅减少了现有国家标准对食品中亚硝胺类化合物的漏检情况；丁红梅等[65]利用二氯甲烷提取腌制生食水产品中的挥发性亚硝胺实现了更高的回收率；周佳等[66]采用同位素内标法通过GC-MS联用技术测定生肉中N-二甲基亚硝胺，检出限低至0.2 μg/kg；Berthiller等[67]使用以甲醇为试剂的正离子模式的气相色谱-化学电离/质谱(GC-CI/MS)测定亚硝胺，在不浓缩萃取液的情况下通过溶剂蒸发获得，避免了亚硝胺的损失；Anna等[68]将样品在Florisil微型柱上纯化后，用气相色谱-化学电离串联质谱法(GC-CI/MS/MS)分析提取物；Nawrocki等[69]用Ambersorb 572和LiChrolut EN的固相萃取技术与GC/MS氨阳性化学电离(PCI)一起开发，亚硝胺的检测限为0.4～1.6 ng/L；Anna等[70]使用配备三重四重分析仪GC/SMB/EI/QQQ/MS的超声分子束电子电离质谱仪测定了14种N-亚硝胺，超声波分子束电子电离离子源可以清除14种被检测的亚硝胺中的13种分子离子，从而显著增加特异性并降低检测较高分子量亚硝胺的技术极限；Fan等[71]使用固相微萃取处理样品，首次检测到啤酒中NPIP浓度过高(>3.8μg/L)；Pedro等[72]将样品在真空蒸汽中蒸馏，再通过胶束电动色谱法来分离和测定不同种类亚硝胺，最后使用GC-MS/MS法确认了该技术的检测结果，相对标准偏差为4.0%～22%；Longo等[73]将样品用二氯甲烷萃取，通过GC-CI/MS联用进行分析，稳定同位素稀释进行定量，检测限达0.04 μg/kg，回收率为76%～81%。GC-MS联用法因其用时短、分离效果好、检出限低、灵敏度高而成为目前检测亚硝胺类物质的常用技术。

3.2.3 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)技术较少用于亚硝胺类物质的检测，主要是因为在紫外光的照射下亚硝胺会发生分解从而影响结果。但该技术对样品要求低，处理过程简单，不仅可以检测挥发性亚硝胺[74,75]，同时对非挥发性亚硝胺、热不稳定或分子量较高的亚硝胺也具有较好的检测能力[76]。洪凰等[77]针对此技术的缺陷，设计出用丹酰氯衍生反应来改变N-亚硝胺的结构，改善了灵敏度和选择性；韩莹等[78]根据亚硝胺类物质特有的紫外吸收特性，采用高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)分离测定水样中的四种亚硝胺，实现了更好的水样加标回收率；Cardenes等[79]将预先脱气的啤酒样品用含有25%的2-丙醇的二乙醚萃取，将产物和丹磺酰氯进行微波辅助反应以形成丹酰基衍生物，在C-18柱上用HPLC分析反应混合物，检出限为0.04 mug/L。

3.2.4 液相色谱-质谱联用技术吴翠华等[80]将样品用乙腈超声提取后，用增强型基质去除固相吸附剂(Enhanced Matrix Removal,EMR)处理，测得NDMA在2.0～50μg/L范围内线性关系良好；王东红等[81,82]利用(UPLC-MS/MS)检测饮用水中亚硝胺，通过对色谱柱和流动相以及多级反应质谱的优化，对NDMA定性和定量检测限分别为0.1、1.0 ng/L；简龙海等[83]将样品加入同位素内标用水蒸汽蒸馏浓缩后，用大气压化学离子化源-液相色谱-四极杆串联质谱仪测定，加标回收率为80%～110%；朱翔等[84]使用椰壳活性炭萃取柱对样品进行预处理，检出限和定量下限分别为1.3～2.8 ng/L和4.0～8.5 ng/L；Liu等[85]将液相萃取与高效液相色谱联用测定亚硝胺，相对标准偏差低于12.8%(n=5)。液相色谱-质谱联用法用于N-亚硝胺类化合物检测的应用还比较少，该技术具有灵敏高、选择性强等优点，对样品的前处理要求较低，更适用于非挥发性、热不稳定或相对分子质量较高的N-亚硝胺类化合物的分析[86]。

3.2.5 热能分析技术热能分析(TEA)技术是目前应用最广泛的亚硝胺化合物检测器，可与气相色谱或液相色谱联用，其原理为色谱分离亚硝胺混合物后再经由TEA裂解室来断裂N-NO键，释放出的亚硝基(NO)被臭氧氧化成电子激发态的NO2，其衰变时发出特征的辐射强度跟亚硝基NO浓度成正比；张红等[87]采用FOSS Kjeltec 8200凯氏定氮仪作为水蒸汽蒸馏装置，蒸馏过程大约只需要16 min，整个蒸馏过程，蒸汽产生量稳定、可控；咸瑞卿等[88]通过气相色谱-热能分析(GC-TEA)法检测样品中NDMA，采用INERTROAP-WAX色谱柱，检测下限为2 ng/mL；刘洪伟等[89]使用GC-TEA仪对医用手套中可迁移性亚硝胺进行检测，10批一次性使用医用橡胶手套中可迁移亚硝胺成分含量为7.46～23.12 ng/g；Byun等[91]利用GC-TEA来分析经过辐照的香肠中挥发性NDMA和NPYR，证明了辐照后香肠中的NDMA和NPYR都显著降低；李文寿等[92]用GC-TEA仪同时测定挥发性亚硝胺，可在同一张GC-TEA色谱图上分离亚硝胺，灵敏度和准确度高，重复性较好；对亚硝胺有高度特异性和灵敏性的TEA仪问世以来便主要用于亚硝胺含量的检测[93]。相比于使用较多的GC-MS，在处理基质较为复杂的样品，尤其是存在相似物质干扰时GC-TEA的稳定性和重复性高于GC-MS，故处理基质较为复杂的样品时可少进行一步净化前处理；但检测器只对含亚硝基的化合物有响应[90]，且检测器的日常维护较为麻烦，故此应用范围较为受限。

3.2.6 分光光度法Luque-Pérez等[94]使用流动注射系统的分光光度法测定食品中的亚硝胺，将亚硝胺的N-NO键用光化学裂解，然后通过Griess试剂的反应，在542 nm处用分光光度法检测亚硝酸盐；Ozel等[95]用综合气相色谱结合氮化学发光检测器(NCD)测定肉制品中的挥发性亚硝胺，检出限和定量限在1.66～3.86 μg/L和6.96～16.71 μg/L之间[96]；Saccani等[97]将N-亚硝胺通过氢溴酸-乙酸产生仲胺并在C18柱分离，在531 nm处进行荧光检测，检测限为8～75 pg。分光光度法操作方便、灵敏度较高，适合于N-亚硝胺的快速检测。

3.2.7 电化学检测通常情况下亚硝胺在铂、金、铜、金刚石、玻璃碳和过渡金属氧化物电极上具有电活性，但裸电极的表面容易污染从而灵敏度和准确度下降，限制了裸电极的使用，因此基于各种修饰电极的电化学技术因其固有的高灵敏度和高选择性受到青睐[98]。Zhu等[99]在多壁碳纳米管(MWCNT)修饰的玻碳电极(GCE)上共价连接胺基聚胺(4.0代，G4-NH4)，可对香肠中亚硝酸盐进行连续监测；电化学中金属离子通常具有良好的催化性能、高的表面积和良好的生物相容性等[100]。天然甲壳素脱乙酰化得到的线性亲水性多糖(CS)具有良好的成膜性能，但导电性较差，因此金属纳米粒子/CS复合材料作为电化学传感平台具有潜在的应用前景。WANG等[101]基于石墨烯(GR)-壳聚糖(CS)和金纳米粒子(AUNPs)修饰的GCE，开发了一种测定亚硝酸盐的电化学传感器；Collyer等[102]利用镀金电极联合选择性地从溶液中吸附亚硝胺离子的杯芳烃单元，降低了亚硝胺的检测限；电化学过程中亚硝胺的氧化中间产物会不可逆的吸附在GCE上，Kozub等[103]修改了吸附材料，并用超声波清洗来保持电极的活性；Ramírez等[104]用SiO2作净化吸附剂，Mcdonald等[105]将样品使用固相萃取后使用同位素对样品处理，从而解决样品处理过程中可能发生的分析变异；Mehmeti等[106]合成了新的石墨烯纳米带玻碳电极(GNs/GCE)，该修饰电极对高峰值电流的亚硝酸盐氧化表现出优异的电催化活性；Yilmaz等[107]发现酸性介质中亚硝酸根的校准曲线在其浓度范围为6～110 μmol/L时呈线性；此外关于电极的修饰还有多种，如基于镍酞菁聚合物修饰电极[108]、纳米铜包覆多壁碳纳米管修饰玻碳电极[109]、聚乙烯基咪唑修饰碳糊电极[110]、白蛋白封端金纳米粒子修饰玻碳电极[111]、核壳结构镍铂纳米粒子修饰石墨烯电极[112]、基于CuO/HC3N4/rGO纳米复合材料电化学传感器[113]、基于离子液体的银粒子修饰碳糊电极[114]、电沉积制备DNA功能化碳纳米管[115]、基底上电沉积ZnO和Pt纳米粒子修饰的纳米复合电极[116]、纳米磁芯壳连接碳纳米管修饰玻碳电极[117]、Cu金属纳米粒子-多壁碳纳米管-还原氧化石墨烯改性玻碳电极[118]、可再生原位铜修饰电极[119]等。尽管修饰电极在亚硝酸盐测定中有着广泛的应用，有允许实时分析等优点[120]，但仍存在一些不足。例如，这些技术的检测限仅限于μmol/L或mmol/L，需要改进[121]。

4 讨论与展望

针对检测亚硝胺的国家标准方法耗时较长，操作复杂的问题，开发更高效的亚硝胺的检测方法显得更 为迫切。HPLC-MS、UPLC-MS/MS、Q-TOF//Q-Exactive在检测亚硝胺时保留时间较长，使得检测效率难以提升；GC-TEA单一性太强，仅能检测亚硝胺，难以大规模应用；相对而言GC-MS的应用最为广泛。由于食品的基质通常较为复杂，检测存在基质干扰、样品前处理损失较多、实验成本较高、前处理繁杂等问题，虽然已有GPC、ASE、QuEChERS等快速前处理技术，但其净化效果仍有优化的空间。目前亚硝胺的检测都依赖于大型仪器和实验室，无法快速得出结果，对亚硝胺的快速检测技术研究仍然较少，开发基于酶联免疫或胶体金试纸法的亚硝胺快速检测技术仍有待研究；同时探究亚硝胺产生过程的关键以及食品中亚硝胺含量变化的影响因素[122,123]，研究亚硝胺的消除机制，降低致癌风险亦是未来亚硝胺研究的一个重要方向。