QuEChERS/气相色谱-三重四极杆串联质谱法同步测定砂仁中28种有机磷农药残留

吴学进，王明月，李春丽，张振山，李萍萍，庞朝海

(中国热带农业科学院 分析测试中心 海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南 海口 571101)

砂仁是姜科豆蔻属多年生草本植物，系四大南药之一，为中国传统大宗常用药材，具有治疗脾胃及妊娠安胎功效。随着其在消化系统、镇痛抗炎及代谢疾病等方面的疗效越来越受到人们的关注，砂仁的人工种植规模也逐步扩大[1]。植物源中药材农药残留可能来自人工种植过程病虫害防治所用农药残留，或由种植环境水土中残留农药污染等。砂仁人工种植产品也面临同样的农药残留超标问题，因此建立砂仁中农药残留快速检测方法对于保障砂仁及其中药制品的产品质量安全，降低人民群众的潜在健康风险具有现实意义。

目前，多组分农药残留的检测方法主要有气相色谱法(GC)[2]、液相色谱法(LC)[3]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[4]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[5]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[6]等。其中GC-MS/MS具有灵敏度高、选择性好、高通量、抗干扰能力强等优点，且采用的多反应监测模式(MRM)不仅解决了气相色谱法和液相色谱法在检测器灵敏度及确证检测技术上存在的不足，还可有效消除GC-MS选择离子扫描(SIM)中存在的离子信息少、定性不准的问题，且仪器价格也较LC-MS/MS低，因此已成为复杂基质样品中多农药残留筛查分析的理想技术。

有机磷类农药因具有广谱、高效、降解快等特点而广泛应用于蔬菜、水果病虫害防治。但此类农药残留可通过食物链在人体内积累，具有神经毒性，可造成神经系统紊乱，还会引起染色体畸变，导致癌变或畸形[7]。QuEChERS方法是近年发展迅速的一种农药多组分残留检测前处理方法，该法因快速、简便、廉价、高效、安全等优点而广泛用于农药多残留快速检测。QuEChERS结合GC、LC、GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS/MS对水果蔬菜中的有机磷类农药残留检测已有大量报道，但应用于中药材中有机磷农残检测的报道较少[8-9]。

本研究以1%(体积分数)乙酸乙腈提取，优化了QuEChERS净化体系，建立了QuEChERS/气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)同时检测砂仁中28种有机磷农药残留的分析方法。方法操作简便、快捷、灵敏度高、重复性好，适用于砂仁中的多种有机磷类农药残留的快速、高效、准确定性与定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Agilent 7890A气相色谱-7000A串联质谱仪(美国Agilent公司)；陶瓷均质子(美国Agilent公司，货号：5982-9313)；MS 3 basic型振荡器(德国IKA公司)；Mettler Toledo电子分析天平(瑞典梅特勒-托利多公司)；TTL-DCII型氮吹仪(北京同泰联科技发展有限公司)；LXJ-Ⅱ型B离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW-80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈、乙酸、乙酸乙酯(色谱纯，美国Fisher公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和十八烷基硅胶键合相(C18)购于美国Agilent公司；石墨化炭黑(GCB)、氯化钠、无水硫酸镁(分析纯，广州化学试剂有限公司)；28种有机磷农药标准品购自天津农业部环境质量监督检验测试中心(质量浓度均为1 000 mg/L)。

实验所用12个砂仁样品购自海南、广东、广西、云南的中药材市场，经广东药科大学药学院王定勇教授鉴定为姜科，豆蔻属多年生草本植物砂仁的干燥果实。

1.3 标准溶液的配制

混合标准储备液：将28种有机磷农药标准品随机分成3组，然后精确吸取1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成3组100 μg/mL混合标准储备液。于-18 ℃冰箱中避光密封储存备用(有效期6个月)。

混合标准储备中间液：准确吸取上述3组混合标准储备液各1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成10.0 μg/mL混合标准储备中间液。于4 ℃冰箱内避光保存(有效期1个月)。

混合标准工作溶液：准确吸取一定体积的混合标准储备中间液于10.0 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，分别配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL混合标准工作溶液。于4 ℃冰箱内避光保存(有效期1周)。

基质混合标准工作溶液：准确吸取2.0 mL净化后的基质空白溶液于15 mL塑料具塞离心管中，在40 ℃水浴下氮气吹干，加入1.0 mL相应质量浓度的混合标准工作溶液复溶，过微孔滤膜(有机相，13 mm × 0.22 μm)，配成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL基质混合标准工作溶液，现用现配。

1.4 样品前处理

制备：12个砂仁样品经粉碎机粉碎，过50目筛，密封袋封装，置于干燥器中保存备用。

提取：称取5.00 g(精确至0.01 g)样品置于50 mL具塞塑料离心管中(内有一个陶瓷均质子)，加入10.0 mL超纯水，振荡涡旋1.0 min后静置20 min，让样品充分润湿；再加入10.0 mL含1%(体积分数)乙酸乙腈溶液，以1 800 r/min振荡涡旋匀质2 min；加入4.0 g NaCl涡旋1 min，然后以4 000 r/min离心5 min。

净化：移取6.0 mL提取上层有机液于15 mL具塞塑料离心管中(内含900 mg MgSO4+150 mg PSA+100 mg C18+25 mg GCB)中，涡旋混匀1 min，以5 000 r/min离心5 min；准确吸取所得净化上清液2.0 mL转移至15 mL具塞塑料离心管中，于40 ℃水浴氮气吹干后加入1.0 mL乙酸乙酯复溶，过有机相微孔滤膜(13 mm×0.22 μm)后上机检测。

1.5 GC-MS/MS检测条件

色谱条件：采用HP-5 MS型色谱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent公司)；程序升温：初始柱温70 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至150 ℃，保持3 min；再以15 ℃/min升至200 ℃，保持3 min；最后以20 ℃/min升至270 ℃，保持3 min；总运行时间20 min。载气为高纯He(纯度≥99.999%)，流速1.0 mL/min；猝灭气为氦气，流速为2.25 mL/min；进样体积1.0 μL；进样方式为不分流进样。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源，电离能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟3.6 min；扫描方式：多反应监测模式(MRM)。28种有机磷农药的保留时间、离子对、碰撞能量等相关参数见表1。

表1 28 种有机磷农药的GC-MS/MS分析参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

以砂仁为基质，将1.0 μg/kg的28种有机磷农药基质工作混合标准溶液在质荷比(m/z)40～500范围内进行全扫描模式(Full scan)扫描。通过NIST谱库检索确定每种农药的保留时间，再根据每种农药化合物的一级谱图选取相对强度高、特征性强的离子作为母离子；然后对母离子采用产物离子扫描模式(Product scan)获得二次碎裂产生的子离子。通过优化碰撞能量对母离子进行碰撞解离，选择丰度值大、特征性强、灵敏度高的两对离子对分别作为该化合物的定量离子对和定性离子对,在多反应监测模式(MRM)下测定，图1为砂仁空白基质中加标量为1.0 mg/kg的28种有机磷农药残留的总离子流(TIC)色谱图。由图可知，20 min 内即可完成对上述28种有机磷农药待测物的分析。

图1 28种有机磷农药砂仁基质标准(1.0 mg/kg)的总离子流色谱图

2.2 提取溶剂的选择

本课题组前期研究比较了丙酮、乙腈和乙酸乙酯提取杨桃基质中氧乐果等37种农药的回收率[10]。结果显示，以丙酮为提取溶剂时，氧乐果等37种农药的回收率较高，但提取出较多的色素等干扰成分，增加了基质效应和仪器维护成本；以乙酸乙酯为提取剂时，37种农药的回收率为60%～120%；以乙腈为提取溶剂时，农药的回收率为70%～120%且提取出的色素等干扰成分比丙酮少。此外，还发现在乙腈中加入1%(体积分数)乙酸，可提高对碱性敏感农药(如乙酰甲胺磷)的回收率。故本研究也选用1%(体积分数)乙酸乙腈为提取溶剂，具体操作为：在样品提取前加入10 mL超纯水，待样品成分润湿，振荡涡旋1.0 min后静置20 min，以提高样品的分散程度；再加入10.0 mL含1%乙酸的乙腈溶液，同时加入4.0 g氯化钠进行盐析，以提高萃取效率。

2.3 净化条件的优化

砂仁是姜科植物果实，除富含乙酰龙脑酯、樟脑等挥发性成分外，也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣质等成分，这些成分易在进样口、衬管等进样系统的前端部位富集，不仅会降低检测灵敏度，还会导致基质效应；既增加了仪器维护的频率和成本，又影响目标农药检测准确度，因此砂仁提取液在上样检测前需净化处理。

农药残留检测中常用的净化剂有PSA、C18、GCB，其中PSA通过极性作用吸附样品中有机酸、脂肪酸和糖等干扰物；在硅胶上键合了十八烷基官能团的C18，通过非极性相互作用，对极性较弱的脂肪酸、挥发油、色素等大分子基质干扰物具有较好的吸附效果；GCB具有片层结构，除对色素、甾醇、芳香烃的吸附能力较好[11]外，还对平面结构及对称性结构的农药化合物也具有较强的吸附作用，但过量的GCB会导致部分农药的回收率偏低[12-13]。本实验选择无水硫酸镁用作除水剂，PSA吸附砂仁中的有机酸、鞣质等极性成分，C18去除砂仁中脂肪酸、色素以及一些非极性成分，GCB去除砂仁中的色素和极性干扰成分，在前期研究[14]基础上，确定MgSO4、PSA和C18的用量分别为900、150、100 mg，再通过调整GCB用量(0、25、50、100 mg)来考察净化效果。结果显示，大部分有机磷农药的回收率为80.0～110%，但随着净化体系中GCB用量由25 mg增至100 mg，三唑磷、喹硫磷、亚胺硫磷、伏杀硫磷和蝇毒磷的回收率均呈递减趋势，其中三唑磷、喹硫膦的回收率分别由94.6%和95.9%降至84.5%和81.5%，亚胺硫磷由87.4%降至69.6%；而对于具有平面结构的伏杀硫磷和蝇毒膦，两者的回收率降低更为明显，分别由89.3%和90.9%降至54.2%和33.1%；由此可知，GCB对三唑磷、喹硫磷有弱吸附作用，对亚胺硫磷有较强吸附作用，对伏杀硫磷和蝇毒磷具有强吸附作用。虽然GCB对部分有机磷农药有吸附作用，但不加GCB时，净化液中砂仁香味稍浓，表明芳香物含量更高，综合考虑回收率及GCB对芳香物的吸附作用，最终确定净化方案为MgSO4900 mg+PSA 150 mg+C18100 mg+GCB 25 mg。

2.4 基质效应

基质效应(Matrix effect，ME,%)是指样品分析液中除目标分析物以外的其他组分，在实际检测时影响分析液的响应值，从而影响目标检测物定量分析的准确度和重现性[15]的现象。基质效应可通过ME(%)=100% ×(B-A)/A来考察，其中A为纯溶剂中待测物标准品的平均响应值，B为空白基质中相同浓度的待测物标准品溶液的平均响应值。ME>0为基质增强效应；ME<0为基质抑制效应。当|ME|≤20%，认为基质效应弱，可以忽略；若其值在20%～50%之间，则表明有中等基质效应；若|ME|>50%，则表明基质效应很强[16-17]。基质效应是残留检测中普遍存在的现象，GC-MS/MS检测方法，更多体现为基质增强效应[18]，这可能是由于在GC-MS/MS系统中，基质的存在减少了色谱系统活性位点与待测目标化合物作用的机会，让更多的待测物进入色谱柱，使其检测信号增强[19]所致。本研究比较了同为0.5 μg/mL的溶剂标准溶液与砂仁基质标准溶液的响应值(表2)。结果表明：28种有机磷农药砂仁基质标准溶液的响应值明显高于纯溶剂标准溶液，均显示为基质增强效应，其中治螟磷等18种有机磷农药在砂仁基质中表现为中等基质增强效应，而甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、久效磷、乐果、甲基对硫磷、杀螟硫磷、硫环磷、亚胺硫磷、蝇毒磷10种有机磷农药在砂仁基质中表现为强基质增强效应，尤其是乙酰甲胺磷和氧乐果的ME值分别高达284%和116%。为提高分析准确度，实验采用基质匹配标准溶液来消除和减弱基质效应的影响。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线及检出限配制质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列基质混合标准工作溶液，在优化条件下上机检测，以待测化合物定量离子对的峰面积(y)为纵坐标，对应质量浓度(x,mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，28种有机磷农药在0.05～1.00 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系(r2≥0.99)。分别以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表2。由表2可知，28种农药的LOD为0.005～0.010 mg/kg,LOQ为0.017～0.033 mg/kg。

2.5.2 精密度与回收率取5.00 g空白砂仁样品，分别加入一定量混合标准溶液，进行0.2、0.40、1.0 mg/kg 3个水平的加标回收实验，每个加标水平平行测定6次，计算28种有机磷农药的回收率和相对标准偏差(RSD)。结果如表2所示，28种农药的平均回收率为82.1%～104%，相对标准偏差(RSD)均不大于15%。

表2 28 种有机磷农药在砂仁中的基质效应、平均回收率、相对标准偏差(RSDs)、回归方程、相关系数(r2)、检出限和定量下限

(续表2)

PesticideMatrixeffects/%Spikes level(mg/kg)Average recovery/%RSD/%Regression equationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)Parathion37.80.2,0.4,1.0102,100,98.44.6,7.7,11y=8.43×104x-3.46×1030.996 30.0100.033Isocarbophos49.00.2,0.4,1.0101,97.5,92.76.2,5.6,9.6y=2.26×104x-6.99×1020.997 50.0070.024Isofenphos methyl27.60.2,0.4,1.0103,97.1,99.25.7,6.4,13y=7.06×104x-1.80×1030.997 80.0100.033Terbufos sulfone29.10.2,0.4,1.0104,99.1,99.96.4,3.9,8.0y=1.66×105x-3.88×1020.998 20.0060.020Phosfolan56.70.2,0.4,1.0102,98.3,90.85.0,5.3,8.8y=4.93×104x-1.46×1030.997 90.0060.020Quinalphos27.60.2,0.4,1.0103,98.6,99.55.5,4.9,12y=1.63×105x-3.63×1030.998 10.0060.020Phenthoate29.20.2,0.4,1.0103,97.1,98.36.3,6.6,13y=9.32×104x-2.80×1030.997 10.0060.020Methidathion45.00.2,0.4,1.0104,98.1,96.66.3,3.6,11y=2.54×105x-6.21×1030.998 30.0080.027Profenophos39.40.2,0.4,1.0103,98.1,95.28.2,7.4,13y=1.92×104x-4.41×1020.998 50.0080.027Triazophos40.20.2,0.4,1.0103,99.4,93.27.1,4.7,13y=6.25×104x-1.42×1030.998 50.0060.020Phosmet59.10.2,0.4,1.0102,99.9,91.86.7,5.7,15y=2.93×105x-7.22×1030.999 00.0100.033Phosalone38.60.2,0.4,1.0104,99.6,97.17.5,5.6,14y=1.48×105x-3.38×1030.998 80.0070.024Coumaphos56.80.2,0.4,1.0104,101,93.25.7,4.8,14y=3.07×104x-5.94×1020.999 50.0050.017

2.6 实际样品检测

应用本方法对海南、广东、云南、广西采集的12批次样品进行检测，均未检出28种有机磷农药，其原因可能为收集的样品多来源于当地药材种植基地，散户药材较少，而中药材种植基地在栽培技术及农药喷施管理方面也更加规范。

3 结 论

本文通过优化QuEChERS前处理方法，建立了气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定砂仁中28种有机磷农药残留的分析方法，涵盖了《中国药典》2015年版“0212药材和饮片检定通则”规定的19种有机磷农药中的16种，方法可在20 min内完成检测，具有操作简单、快捷、灵敏度高、重现性好等优点，适用于砂仁中28种有机磷农药残留的检测。该方法的建立，不仅对砂仁中农药残留具有一定应用价值，还可为姜科同属或其他中药材中的农药残留检测提供技术参考，为保障我国中药材的质量安全提供技术支持。