39个木槿品种亲缘关系SRAP分析

赵艺璇，王 鑫，田 琳，李明阳，刘易超，刘冬云*

（1.河北农业大学园林与旅游学院，河北保定 071000；2.河北润丰林业科技有限公司，石家庄 050000）

木槿（Hibiscus syriacus）是我国北方园林绿化常用的灌木或小乔木。木槿花色花型丰富，按颜色分有白色、粉色、蓝色和紫色木槿，按花型分可分为单瓣木槿、半重瓣木槿和重瓣木槿。木槿花期极长，6—10 月可连续开花，弥补了我国北方园林绿化中夏秋缺少开花木本植物的不足。木槿原产于中国，可适应我国大部分地区的环境条件，在全球范围内也有广泛应用[1]。木槿适应性很强，可抵抗洪涝、干旱等各种恶劣环境。此外，木槿还可对抗SO2、Cl2等有毒气体，阻滞尘埃，是园林绿化的优良树种[2]。木槿品种繁多，韩国、美国、比利时等国家已培育出了200 多个新品种。长时间以来，由于不断的人工杂交和自然选择，使得木槿品种关系混乱，来源不明。因此，今后引种、育种过程特别应该在弄清品种来源的前提下有目的地进行。序列相关扩增多态性标记（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一种基于PCR 反应，独特的引物设计对开放阅读框（ORFs，open readings frames）进行扩增的分子标记，因各个品种ORF 序列不同而产生不同的谱带，相较于随机扩增多态性DNA 标记（RAPD）法，可产生大量且清晰的多态性谱带[3]。目前，SRAP 已广泛应用于石斛兰（Dendronbium nobile）[4]、杜鹃（Rhododendron simisii）[5]、杜仲（Eucommia ulmoides）[6]、高丹草（Sorghum sudanense）[7]、三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）[8]等多种植物种质鉴定及遗传多样性研究中。目前，针对木槿分子标记的研究较少，J.H.KIM等人使用RAPD 法分析了26 个木槿品种的遗传关系[9]；肖芬从100 条ISSR 引物中筛选出6 对适用于木槿，可扩增条带多且清晰的引物[10]，H.AN 等人使用AFLP 法研究了华木槿、庐山木槿和不同品种木槿之间的亲缘关系，认为AFLP 法可以区分不同品种木槿[11]。但利用RAPD 和AFLP 对木槿遗传多样性检测效率较低且操作步骤繁琐。因此，需要开发新的分子标记方法对木槿遗传多样性进行研究。

本研究利用SRAP 分子标记技术和琼脂糖凝胶电泳对39 个木槿品种亲缘关系进行分析，以期从分子水平确定其亲缘关系，为木槿品种鉴定、品种保护及杂交育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用39 个木槿品种见表1。

1.2 DNA提取方法

每个品种从5 个单株中各取2 张幼嫩叶片，混合取样 2 g，试验使用 CTAB 法提取 39 个木槿（Hibiscus syriacus）品种 DNA。

CTAB 法提取木槿DNA 具体方法如下：

取2 g 幼嫩木槿叶片加入液氮充分研磨，加入预热30 min 的 65 ℃ 1000 μL CTAB 提取液，然后加入100 μL 巯基乙醇，加入预热的CTAB 提取液补满离心管；65 ℃温水浴30 min，每5 min 震荡1次，取出晾至室温后10 000 rpm 离心4 min 后取上清液 750 μL 至 1.5 mL 离心管，加入 750 μL 氯仿：异戊醇（24∶1）充分混匀，10 000 rpm 离心 15 min，重复此步骤3 次；取上清液600 μL 至1.5 mL 离心管，加入 400 μL 预冷异丙醇和 300 μL 5mmol/L NaCl，轻轻摇匀后-20 ℃放置 3～5 h 后 12 000 rpm 离心20 min 收集沉淀，去上清，70%乙醇 400 μL 10 000 rpm离心3 min 2 次；无水乙醇400 μL 洗1 次，弃上清，吸走多余溶液，37 ℃开盖干燥10 min 然后加入50 μL ddH2O 和 2 μL rNase 酶放入-20 ℃冰箱保存。

表1 供试木槿品种的编号、品种名称Table l The number, genotype name of Hibiscus syriacus

最后用Thermo 微量紫外分光光度计检验其浓度和纯度，然后稀释到20 ng/μL 备用。

1.3 SRAP引物和筛选

根据Li G.提出的SRAP 引物设计原则设计引物[12]。本试验设计上游引物及下游引物各16 条，配对为256 对引物。选取欧洲花叶木槿（H.s'Argenteovariegata'）、长苞重瓣木槿（H.s.var.longibracteatus）、雅致木槿（H.s.f.elegantissimus）和木槿（Hibiscus syriacus）作为DNA 模板，进行SRAP 分子标记引物组合的筛选。从256 对SRAP 引物组合中筛选扩增条带清晰、多态性条带较多、重复性好的引物进行39 个木槿品种亲缘关系分析。SRAP 引物序列信息见表2。

25 μL PCR 反应体系：Taq PCR Master Mix 12.5 μL；DNA 1 μL（20 ng/μL）；上游引物、下游引物各 1 μL；ddH2O 9.5 μL。

表2 SRAP 引物序列信息Table 2 The name and base sequence of SRAP primers

PCR扩增程序：94℃5min；94℃1min，37℃1min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，32 个循环；72 ℃ 10 min，PCR 反应在 BIO-RAD 基因扩增仪上进行。

扩增产物经Thermo 微量紫外分光光度计检测其质量和浓度，1% 琼脂糖凝胶电泳（1× TAE 缓冲液，100 V，0.5 h）对扩增产物进行检验，6× SuperStain染色。

1.4 数据分析

将琼脂糖凝胶电泳图中清晰、无拖带、易分辨的条带记为“1”，反之则记为“0”。根据人工读带结果，在Excel 表格中，将引物名称作为纵坐标，木槿名称作为纵坐标建立矩阵[12]。利用NTsys 2.10 软件，使用UPGMA 法绘制聚类分析图。使用POPGENE软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon's 信息指数（I）、Nei's 基因多态性（H）等指标[13]。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

选取欧洲花叶木槿、长苞重瓣木槿、雅致木槿和木槿4 个品种对256 对SRAP 引物进行初步筛选。然后，利用39 个木槿品种DNA 样本进行SRAP引物的进一步筛选。结果表明，在26 对初筛选引物中，有10 对引物的扩增条带清晰且多态性丰富，部分结果如图1 所示。

2.2 SRAP标记多态性分析

从256 对中筛选出的10 对SRAP 组合可扩增出88 条明亮，无拖带，重复高的谱带，其中，共扩增出多态性条带72 条，多态性百分比为81.81%（表3）。每对组合平均可扩增条带8.8 条，多态性条带7.2 条。这 10 对 SRAP 引物组合可扩增出 6～12 条数目不等的条带，部分扩增结果如图2、图3。其中Em7/Me5 和Em9/Me15 产生条带多态性百分比最低，均为66.67%。Em4/Me13 产生条带多态性百分比最高，为100%。以上结果表明，本试验的39 份木槿样本多态性位点较多，异质性高，即这39 个木槿品种变异较为广泛，遗传基础宽。

图1 部分引物筛选结果Figure 1 PCR amplification of SRAP primer combinations

2.3 木槿遗传多样性分析

利用 POPGENE 1.32 分析39 个木槿品种DNA多样性。结果表明，木槿等位基因数（Na）值为1.181，木槿有效等位基因数（Ne）值为 1.597 0，Nei's 基因多样性（H）为 0.332 8，Shannon's 多样性信息指数（I）为0.428 7，表明39 份木槿种质资源基因组DNA 多态性较高，基因库较为丰富有着广泛的遗传基础。

表3 10 对SRAP 引物在木槿品种中的多态性分析Table 3 Polymorphism for Hibiscus syriacus varieties using 10 SRAP primer pairs

图2 SRAP 引物Em7/Me13 的PCR 扩增电泳图谱Figure 2 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by SRAP primer Em7/Me13

2.4 SRAP标记聚类分析

利用软件NTsys 2.10 对原始数据矩阵进行处理，根据UPGMA 法对39 份木槿样本SRAP 分子标记结果进行聚类分析。结果表明在遗传距离为0.759 处，39 个木槿品种被分为5 类，第Ⅰ类包括白花单瓣木槿、长苞重瓣木槿、雅致木槿、粉花重瓣木槿及其他木槿品种，第Ⅱ类包括‘红心’‘粉色雪纺’‘薰衣草雪纺’3 个木槿品种，第Ⅲ类包括单瓣紫粉木槿；第Ⅳ类包括普通粉色重瓣木槿；第Ⅴ类包括牡丹和白花重瓣2 个品种（图4）。

图3 SRAP 引物Em12/Me4 的PCR 扩增电泳图谱Figure 3 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by SRAP primer Em12/Me4

图4 39 个木槿品种的SRAP 聚类图Figure 4 SRAP dendrogram of 39 Hibiscus syriacus cultivars

3 讨论与结论

遗传多样性即在种内不同群体或一个种群不同个体产生的遗传变异，是产生物种差异和生物多样性的基础。了解木槿种质资源的遗传多样性，对推动木槿资源更深层次的开发和利用，具有现实指导意义[15]。SRAP 分子标记由于操作简单，引物扩增稳定、重复性好，具有通用性，开发成本较低，标记位点中共显性标记比例较高，且在基因组中均匀分布等特点，得到很多研究者的青睐[16]。但在前人的研究中，未曾有过关于SRAP 分子标记技术应用于木槿的报道。本研究从256 对中筛选了10 对可应用于木槿遗传研究的SRAP 组合，这10 对引物共扩增出88 条谱带，多态性百分比为81.81%，扩增条带多态性高且图像清晰，无拖带现象。由此可见，SRAP分子标记技术可应用于木槿种质资源的系统分类、亲缘及进化关系鉴定、品种鉴别、亲本选择，为木槿种质资源研究提供理论基础。

本试验利用 POPGENE 1.32 分析了39 份木槿样本DNA 多样性。结果表明，39 个木槿品种基因组DNA 多态性较高，基因库较为丰富，有着广泛的遗传基础。

Van H.等[11]使用 AFLP 法对华木槿、庐山木槿以及木槿品种之间的遗传关系进行了研究。研究结果表明，木槿的亲缘进化关系与其表型性状之间无明显联系，但肖芬等[17]对27 个木槿品种进行了数量分类，认为有无丹心、花型、丹心线与丹心关系和丹心基部形状可作为木槿形态分类的主要指标。在本研究中，第Ⅰ类又可分为4 种花型，包括蓝紫色重瓣木槿，比如‘欧洲花叶木槿’‘紫裙’‘蓝莓冰沙’和‘法国红色酒馆’，且此4 个品种丹心线与丹心近等长；这4 个品种遗传关系较近均遗传关系较近，而蓝紫色单瓣木槿‘夏威夷’‘蓝色锦缎’‘细叶’和‘玛丽娜’遗传关系较近，且此类4 个品种丹心线均超出丹心，粉白色重瓣木槿包括‘粉色铅笔’‘薄荷’和‘千丝绊’，丹心线与丹心近等长，粉紫色单瓣木槿‘蓝鸟’‘粉红巨人’和‘紫柱’丹心线明显超出丹心，第Ⅱ类包括‘红心’‘粉色雪纺’‘薰衣草雪纺’3 个木槿品种，均为粉白色木槿，第Ⅲ类包括单瓣紫粉木槿；第Ⅳ类包括普通粉色重瓣木槿，第Ⅲ类和第Ⅳ类均为粉紫色木槿，第Ⅴ类包括牡丹和白花重瓣2个品种，为粉白色木槿。因此，本研究认为木槿的系统分类主要与花瓣颜色、丹心与丹心线关系、瓣型有关，与肖芬的研究存在一致性。

本研究使用UPGMA 法聚类分析了39 个木槿品种的遗传关系。当遗传距离为0.759 时，39 份木槿样本被聚为5 类。长苞重瓣木槿、雅致木槿、粉花重瓣木槿等木槿变种及其他木槿品种被分为第Ⅰ类；普通粉色重瓣这个变种单独被分入第Ⅳ类，而牡丹木槿和白花重瓣两个木槿变型品种被分入了第Ⅴ类。张铮等[18]人从木材解剖学角度研究了5 个品种木槿进化关系，该研究认为，雅致木槿属于较原始的类群，而白花重瓣木槿和牡丹木槿2 个类群相对较为进化。本研究中，雅致木槿和木槿在遗传距离为0.853 处，仍可被聚为一类，两者亲缘关系较近，由此可以推断雅致木槿较为原始，牡丹木槿和白花重瓣木槿较为进化，与张铮和肖芬研究结果一致[10，18]。

综上所述，本研究认为木槿亲缘关系远近与其表型性状存在一定联系，雅致木槿进化程度较低，而牡丹木槿和白花重瓣木槿较为进化。本试验使用SRAP 分子标记法对木槿亲缘关系进行了研究，为木槿亲缘关系研究及杂交育种亲本选育提供了重要的理论依据。