大泷六线鱼仔稚鱼脊柱及附肢骨骼系统的发育观察

于超勇，官曙光，于道德，赵文溪，宋静静，盖珊珊，张伟，刘莹

(山东省海洋生物研究院 山东省海水健康养殖工程技术研究中心，山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266104)

骨骼系统是鱼类支撑身体、保护内脏器官及协调肌肉运动的重要组织之一，在长期的进化过程中各种骨骼发育时序、形态、构造与其栖息环境形成了显著的适应进化。鱼类骨骼系统的形态和结构特征，是研究鱼类系统进化和分类的重要依据[1]，也是深入研究鱼类组织器官功能发育的重要途径[2]。鱼类骨骼发育是一个复杂的过程，骨骼发育的异常会影响鱼类的外部形态与功能需求。在鱼类早期发育过程中，其游泳模式、游进速度、摄食方式及习性的改变均与骨骼的发育密切相关，骨骼的正常发育可在一定程度上决定着鱼类的生存率及生长速率[3]。基于上述原因，相关学者对多种海水经济鱼类开展了骨骼发育特点及其规律研究，如齿鲷Dentexdentex[3]、美洲鲥Alosasapidissima[4]、卵形鲳鲹Trachinotusovatus[5]等，研究发现，硬骨鱼类因种属差异，在骨骼发育方面存在明显的不同，因此，明确不同鱼类骨骼早期发育规律，不仅可为了解鱼类早期生活史提供基础资料，而且能有效解释不同鱼体构造与功能形成间的适应性关系[6]。与此同时，详细了解鱼类骨骼的系统发育时序，对于有效鉴定人工繁育过程骨骼畸形的发生起到至关重要的作用[3]。

大泷六线鱼Hexagrammosotakii隶属于鲉形目Scorpaeniformes六线鱼科Hexagrammidae六线鱼属Hexagrammos，广泛分布于中国黄渤海沿岸，以及日本、朝鲜和俄罗斯远东海域[7-9]，大泷六线鱼为恋礁性鱼类，在孵化初期已具备一定的游泳能力[10]，仔鱼时期巡游模式的建立为大泷六线鱼外源性摄食提供了条件，此时鱼体可摄食浮游动植物[11]；大泷六线鱼主要生活区域随着鱼体的生长由中上水层逐渐向底层水层迁移，其成鱼虽不喜游动，但具有较强的加速能力、方向控制能力与摄食能力，能够灵活穿梭于礁石之间[9]，可摄食鱼类、虾蟹类等小型生物[12]。大泷六线鱼因其肉质细腻、味道鲜美，现已成为中国北方网箱养殖主要品种，也是开拓礁湾放流、海洋牧场增殖和发展游钓业的理想品种[8-9]。基于大泷六线鱼对海洋渔业的重要性，国内学者在大泷六线鱼生态学和繁殖生物学方面开展了大量的研究[10,13-15]，但有关大泷六线鱼仔稚鱼脊柱及附肢骨骼系统的发育规律研究尚未见报道，且目前鲉形目鱼类骨骼发育的研究也较少，仅有崔国强等[16]对日本鬼鲉Inimicusjaponicus脊柱和附肢骨骼，以及邓平平等[17]对褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus骨骼系统的早期发育观察研究。本研究中，通过软骨-硬骨双染色法，对大泷六线鱼的仔稚鱼发育过程中脊柱和附肢骨骼的形态变化进行了连续观察与分析，阐释了大泷六线鱼早期骨骼生长发育规律及其特殊性，揭示了大泷六线鱼骨骼早期发育与功能发育间的关系，旨在为大泷六线鱼早期发育与分类鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大泷六线鱼仔、稚鱼早期发育的各阶段样本采自威海圣航水产科技有限公司。大泷六线鱼亲鱼(2～3龄)采自辽宁省大连市黑石礁海区海上网箱养殖区，亲鱼个体健康无伤、活力强，待亲鱼成熟后，采用腹部挤压法获得优质卵子与精液并进行人工干法授精。

1.2 方法

1.2.1 大泷六线鱼仔稚鱼培育 受精卵在14～15 ℃孵化条件下，经21 d左右孵出仔鱼；初孵仔鱼转移到培育池中培育，海水盐度为28～30，pH为7.8～8.2，溶解氧≥5 mg/L，曝气，光照强度为500～1000 lx。在此过程中，受精卵获取、孵化、饵料体系和养殖管理均参照相关技术流程[14-15]。

1.2.2 大泷六线鱼仔稚鱼样本采集及保存 每天8:00(投喂前)自两个培育池中分别随机取样50～60尾，样品采集流程为：初孵仔鱼～31日龄时每日取样一次，35～60日龄时每5 d取样一次；样品采集后，用MS-222进行麻醉，待仔稚鱼完全沉入烧杯底部后，将其收集存入10%福尔马林溶液中，置于冰箱(4 ℃)中保存，保存期间定期更换新鲜10%福尔马林溶液。

1.2.3 大泷六线鱼仔稚鱼骨骼染色方法 从大泷六线鱼仔稚鱼每组采样样本中随机选取20尾进行骨骼染色。仔稚鱼骨骼染色主要参照杨安峰[18]软骨-硬骨双染色方法，其操作步骤主要包括软骨染色液(10 mg阿利新蓝8GX+80 mL 95%乙醇溶液+20 mL冰乙酸)染色，乙醇溶液梯度复水，胰蛋白酶溶液(30 mL饱和硼酸钠水溶液+70 mL蒸馏水+1 g胰蛋白酶)消化处理，硬骨染色液(0.5%KOH溶液+足够的茜素红，直至溶液呈现深紫色)染色，0.5%KOH-甘油合剂梯度脱色，3%H2O2溶液色素漂白，以及加有麝香草酚的纯甘油密封保存等步骤。

1.2.4 大泷六线鱼骨骼染色标本观察及相关数据采集 染色处理好的仔稚鱼样品全部在Olympus SZ61型体视显微镜下进行观察，详细记录仔稚鱼各发育时期的骨骼特征，并利用数码相机显微照相进行照片采集，采集的图像用 Adobe Photoshop CS 软件(www.photoshop.com)进行处理。

1.3 数据处理

从初孵仔鱼到60日龄仔稚鱼的全长用游标卡尺测量(精确到0.01 mm)，所有的全长数据均采用 SPSS 16.0 软件进行分析，试验结果均用平均值±标准差(mean±S.D.)表示。

2 结果与分析

2.1 脊柱的发育

大泷六线鱼脊柱椎骨数量为50枚，其中，躯椎骨20枚，尾椎骨30枚。大泷六线鱼初孵仔鱼已具备完整的未分节线状脊索，且已出现全部髓弓及脉弓(图1-A)；10日龄(图1-B)时，髓棘与脉棘分别由髓弓和脉弓末梢延长形成，并由脊柱前端向后出现，直至19日龄(图1-C)时，髓棘与脉棘全部形成；27日龄(图1-D)时，腹部椎体横突由前向后首先开始骨化，腹肋可见，至28日龄(图1-E)时髓弓、脉弓开始由前向后骨化，随后椎体硬骨环于脊柱前段出现，并向后延伸骨化；35日龄(图1-F)时，髓棘和脉棘开始由前向后骨化；40日龄(图1-G)时，硬骨环全部形成，且前端硬骨化程度最高，往后依次降低；至45日龄(图1-H)时，椎体硬骨化基本完成；50日龄(图1-I)时，脊柱全部完成硬骨化。

2.2 尾鳍的发育

大泷六线鱼初孵仔鱼的脊索末端呈直线状(图2-A)；6日龄(图2-B)时，第1尾下骨形成；8日龄(图2-C)时，第2、3尾下骨形成；9日龄(图2-D)时，侧尾下骨形成；12日龄(图2-E)时，第1尾上骨与第4尾下骨形成，第1、2尾下骨及侧尾下骨开始融合，尾鳍条出现；15日龄(图2-F)时，2、3尾上骨形成，尾鳍已初具形态，此时脊索末端形成尾杆骨，并已斜向上弯曲；20日龄时，第5尾下骨出现，第3、4尾下骨完成融合(图2-G)，第2、3尾下骨之间空隙将尾鳍鳍条分为上下两部分；35日龄(图2-H)时，第3、4、5尾下骨已融合；35～55日龄期间，大泷六线鱼尾部骨骼复合物中，尾杆骨首先开始骨化，随后是侧尾下骨、尾下骨与尾鳍条相继开启骨化过程，3个尾上骨最后开启硬骨化过程(图2-I、J、K)；55日龄(图2-L)时，尾部骨骼全部骨化完成，尾鳍中间微凹。

2.3 背鳍的发育

大泷六线鱼14日龄(图3-A)时，背鳍开始发育，此时已出现8枚近端桡骨；17日龄(图3-B)时第二背鳍支鳍骨先于第一背鳍形成；25日龄(图3-D)时，第二背鳍远端桡骨，背鳍条形成，第一背鳍近端桡骨开始出现；31日龄(图3-E)时，第一背鳍远端桡骨及背鳍条发育完成；40～55日龄期间，背鳍条首次发生骨化，随后支鳍骨由头端至尾端发生骨化(图3-F，图3-G)，背鳍条首先发生骨化，随后支鳍骨由头端至尾端发生骨化；60日龄(图3-H)时，背鳍基本骨化完成，此时所有远端桡骨仍为软骨。

2.4 臀鳍的发育

大泷六线鱼仔鱼15日龄(图4-A)时，14枚臀鳍支鳍骨近端桡骨出现；20～27日龄(图4-B、图4-C)时，支鳍骨远端桡骨及臀鳍条全部发育完成，且Stay软骨出现；40～50日龄(图4-D、图4-E)时，前端臀鳍支鳍骨近端桡骨由中间向两端开始骨化，随后，臀鳍条骨化开始；60日龄(图4-F)时，臀鳍除远端桡骨仍为软骨之外，其他臀鳍元件均已完成骨化。

2.5 胸鳍的发育

胸鳍为大泷六线鱼初孵仔鱼唯一存在的鳍原基(图5-A)，主要包括乌喙骨-肩胛软骨，6日龄(图5-B)时，细长条状匙骨与胸鳍板出现，乌喙骨-肩胛软骨紧贴前部匙骨，成弓形；19日龄(图5-C)时，胸鳍板内出现缝隙，并逐步转变为远端桡骨与近端桡骨，肩胛骨、乌喙骨进一步发育，且肩胛骨上部出现肩胛骨孔；20日龄(图5-D)时，胸鳍板内已出现3个横向裂缝，胸部鳍条出现；乌喙骨前方匙骨为脊柱与附肢骨骼中首先发生骨化的元件(图5-E)，随后胸鳍条开始骨化；31～60日龄(图5-F～I)时，胸鳍条、乌喙骨、肩胛骨、支鳍骨相继骨化，至试验结束时支鳍骨未完全骨化。

2.6 腹鳍的发育

大泷六线鱼腹鳍出现较晚，16日龄(图6-A)时，腹鳍支鳍骨出现；20日龄(图6-B)时，腹鳍支鳍骨末端出现腹鳍鳍基软骨，且随着鱼体的生长，基鳍软骨逐渐变大；直至29日龄(图6-C)时，腹鳍条出现，且腹鳍基鳍软骨已发育为一对类似三角形的骨骼元件，并且存在部分愈合；至31日龄(图6-D)时，支鳍骨首先由前至后发生骨化，随后腹鳍条开始骨化(图6-E)；最后，鳍基软骨开始硬骨化，直至60日龄(图6-F)时，腹鳍骨骼骨化基本全部完成。

3 讨论

3.1 大泷六线鱼骨骼系统发育的适应性

鱼类骨骼系统发育是一个非常复杂的过程，其早期发育顺序不仅与仔稚鱼的胚胎、胚后发育密切相关，同时也与鱼体对环境的适应性及鱼类早期功能发育相关联。本研究中应用软骨-硬骨双染色方法，对大泷六线鱼仔稚鱼脊柱及附肢骨骼系统进行了研究与分析，以期清晰观察其骨元件的形成与骨化过程，明确脊柱及附肢骨骼系统发育对于大泷六线鱼早期运动与摄食功能形成的适应性关系。

3.1.1 骨骼发育与运动能力密切相关 鱼类脊柱及附肢骨骼的发育与仔稚鱼运动能力密切相关[3]。与青鳉Oryziaslatipes[19]相似，大泷六线鱼骨骼发育始于胚胎时期，初孵仔鱼已具备脊索、髓弓、脉弓及胸鳍原基等骨骼元件(图1-A，图5-A)，脊柱与胸鳍的形成使大泷六线鱼初孵仔鱼具备了基本的支撑能力和移动能力，因此，大泷六线鱼仔鱼在出膜1～2 h后，已具备了进行间歇性运动的能力[10]。尾鳍作为鱼类重要的推进器官，其摆动可为鱼类向前游进提供动力，据邱丽华等[11]的报道，大泷六线鱼仔鱼早期的运动模式为巡游运动模式。本研究中，大泷六线鱼尾鳍在6日龄时开始发育，其与脊索、胸鳍相互配合，为巡游模式的建立提供了条件，此时鱼体初步具备了向前持续运动的能力；大泷六线鱼翻转制动能力的获得与胸鳍板的形成及进一步骨化相关联，背鳍、臀鳍与腹鳍相继发育，使大泷六线鱼具备了较好的平衡能力[20]，运动能力进一步加强。与胡发文等[10]的观察相似，在本研究的苗种培育过程中观察到50日龄前后，大泷六线鱼开始潜入底层水层，只在投饵时迅速游至水面获取食物，此时，大泷六线鱼虽不喜游动[15]，但爆发性运动能力加强，其运动模式转变为机动运动模式[21]，此阶段，大泷六线鱼脊柱及附肢骨骼基本骨元件均已形成并逐步完成骨化，尾鳍在骨化的尾端脊柱的紧密配合下为鱼体提供更为强劲的推动力[16]，使大泷六线鱼具备了瞬间加速的能力，骨化后的其他附肢骨骼相互配合，使鱼体平衡、制动、倒游与转向能力进一步加强，特别是腹鳍、背鳍与臀鳍的骨化提升了鱼体的平衡性，使鱼体可长时间稳定在底层水面，底栖习性显现。由此可推断，鱼体爆发性游动能力及平衡稳定能力的增强与骨骼发育密切相关。综上所述，大泷六线鱼脊柱与附肢骨骼的发育与其运动模式相适应，并为其由巡游模式向机动模式转变提供了保障。

3.1.2 骨骼发育与摄食能力密切相关 鱼类脊柱及附肢骨骼的发育与仔稚鱼摄食能力也存在极其紧密的联系[3]。海洋鱼类的仔鱼主要以吞噬浮游动植物为主，其外源性摄食能力的获得建立在搜索、摄取活饵料的相关器官形成的基础之上，大泷六线鱼仔鱼的混合营养期只有2 d，仔鱼必须在该阶段内建立外源性摄食关系[11]。本研究中发现，大泷六线鱼脊索形成于胚胎时期(图1-A)，尾鳍的发育发生在卵黄囊耗尽前(图2-B)，胸鳍板、尾下骨及侧尾下骨形成(图5-B，图3-C)开始于鱼体摄食轮虫、卤虫等外源性营养之前(该阶段标本腹部可观察到食物残渣可印证这一结论)，脊索作为头部骨骼提供支撑力的重要器官，尾鳍与胸鳍作为鱼类摄取饵料提供动力的重要器官，其发育为大泷六线鱼内外营养转换提供了基础。大泷六线鱼处于仔鱼后期时，尾鳍及胸鳍基本骨元件均已形成，尾鳍与胸鳍在脊柱的支撑下，为大泷六线鱼提供了追逐食物的能力，胸鳍中匙骨的骨化(图5-E)支撑了胸舌骨肌，进一步增强鱼体的摄食能力[22]，外源营养物质大量摄入体内，使大泷六线鱼进入快速生长期[10]。大泷六线鱼在稚鱼后期至幼鱼阶段时，鱼体开始潜入水底，在捕食时可迅速蹿出水面，摄食后又迅速返回原隐蔽处[23]，直线摄食行为显现，此阶段大泷六线鱼脊柱及附肢骨骼所有骨骼元件逐步骨化完成，发达的胸鳍骨骼为大泷六线鱼短途冲刺捕食猎物提供了条件[9]，骨化的尾鳍在脊柱的带动下大幅度提升大泷六线鱼捕食时的加速能力，捕食能力进一步加强。综上所述，大泷六线鱼脊柱与附肢骨骼的发育与其摄食能力相适应，并为其外源性摄食能力的获得与增强提供了基础条件。

3.2 大泷六线鱼骨骼系统发育的特殊性

3.2.1 不同鱼类骨骼发育时序差异 不同硬骨鱼类仔稚鱼脊柱与附肢骨骼发育时序不尽相同[22，24-25]。大泷六线鱼骨骼系统发育也有其特殊性，就骨骼发育时间而言，大泷六线鱼脊柱、髓弓、脉弓、胸鳍的发育始于孵化前，这可能与其较大的卵径及较长的孵化时间[13]有关，鱼卵储存的营养物质及较长的孵化时间足以为胚内骨骼系统发育提供营养基础与时间储备；然而大泷六线鱼脊柱椎体骨化时间又明显晚于其他双侧对称体型鱼类，且脊柱与附肢骨骼发育耗时较其他鱼类长[16,26]，考虑到大泷六线鱼为秋、冬季产卵鱼类，水温低[14]，生长速度较慢，据此推测大泷六线鱼骨骼系统发育耗时较长可能与其低温生长环境有关。

鱼类附肢骨骼的出现时间、发育顺序及形态结构也存在一定的种间差异[16]。与褐菖鲉[17]、鞍带石斑鱼Epinepheluslanceolatus[27]等大多数海水鱼类相同，大泷六线鱼附肢骨骼最先出现的为胸鳍，其次为尾鳍、背鳍、臀鳍，最后为腹鳍。本研究中观察发现，大泷六线鱼早期于水体上层生活，活动能力强，而后期主要生活在水体底层，不喜游动。由于胸鳍与尾鳍是提升鱼体游动能力的器官，背鳍、臀鳍与腹鳍是提高鱼体平衡能力的器官[20]，因此，大泷六线鱼以上的生活习性转变可能与附肢骨骼的发育顺序有关。值得注意的是，与大菱鲆Scophthalmusmaximus[28]相同，本研究中大泷六线鱼胸鳍、尾鳍的发育明显早于其他附肢骨骼，这是由于与摄食和游动相关的骨骼优先发育可催生大泷六线鱼的主动摄食能力[17]，从而迅速完成由内源性营养向外源性营养的转变；腹鳍虽发育晚，但发育迅速，腹鳍的率先骨化与胸鳍的相互配合能够有效组织大泷六线鱼头尾的上下摆动，维持鱼体的平衡游动；大泷六线鱼胸鳍发达[9]，这可能是其最后完成骨化的原因；另外，大泷六线鱼的背鳍及臀鳍均自中间向头、尾两端发育，且第二背鳍与臀鳍较第一背鳍优先发育，第二背鳍与臀鳍靠近尾鳍，其优先发育可辅助未发育完全的尾鳍发挥其推进功能[21]。大泷六线鱼脊柱由头端至尾端发生硬骨化，其髓弓、脉弓、髓棘、脉棘均由基部向末梢硬骨化，这与日本鬼鲉[16]、菊黄东方鲀Takifuguflavidus[26]、塞内加尔鳎Soleasenegalensis[29]等底层鱼类相同，而长距离洄游性鱼类如美洲鲥[4]、尖吻鲈Latescalcarifer[2]等，其脊柱则由头尾两端向中间发生硬骨化，鱼类在早期发育过程中形态结构与功能需求相互影响[17]，鱼类脊柱骨化方式可能与鱼类生态习性的形成相对应，但其机理还需进一步分析明确。

3.2.2 不同鱼类骨骼结构比较 大泷六线鱼同大部分海水鱼类，如卵形鲳鲹Trachinotusovatus[5]和金头鲷Sparusaurata[30]相同，拥有5片大小不一的尾下骨。大泷六线鱼作为分类地位较高的鲉形目鱼类，其尾下骨在发育过程中会发生高度联合现象，形成几乎无缝隙的上下两叶，其联合方式与同为鲉形目的日本鬼鲉[16]、褐菖鲉[17]等完全一致，而分类地位较低的鲱形目鱼类尾下骨则联合程度较低，例如，刀鲚Coilianasus[31]仅第2侧尾下骨与第1尾下骨基部发生联合，美洲鲥[4]与远东拟沙丁鱼Sardinopsmelanostictus[32]仅存在第1尾下骨和第2尾下骨融合的趋势等，由此也可印证了尾下骨联合现象可为鱼类系统进化分类提供依据[33]，且鱼类骨骼形态对于鱼类分类学意义重大。鱼类尾部骨骼信息能够促进了解鱼类不同发展阶段的功能趋势和环境偏好[34]。尾下骨高度联合的大泷六线鱼喜静止，爆发性游泳能力极强，体长为10～22 cm的大泷六线鱼，爆发性游速可达81.69～121.25 cm/s[35]，而尾下骨联合程度较低的美洲鲥[36]，爆发性游动能力较弱，但其具有不间歇运动性，持续运动能力强，由此可初步推断鱼体爆发性游泳能力可能与尾下骨的高度联合有关，即高度联合的尾鳍可能使其产生更强的尾推力，从而大幅度提高鱼体瞬间捕食和躲避天敌的能力。此外，不同鱼类尾上骨也存在较大差异，例如菊黄东方鲀[26]无尾上骨，塞内加尔鳎[29]具有1枚尾上骨，美洲鲥[4]具有2枚尾上骨，刀鲚[31]拥有3枚尾上骨，但在发育过程中，尾上骨会发生融合等现象，大泷六线鱼拥有3个尾上骨，且不会发生融合，这与日本鬼鲉[16]、大菱鲆[28]、真鲷Pagrosomusmajor[37]等相同，但目前还未有对尾上骨功能的相关报道，不同鱼类尾上骨数量及融合程度在进化和功能上的意义还需进一步研究与探讨。

不同种类鱼类早期骨骼在生物遗传进化上存在一定的一致性，但也各有不同。本试验中通过对大泷六线鱼脊柱和附肢骨骼的发育过程进行了观察与分析，确定了大泷六线鱼骨骼发育时序及特征，有助于进一步了解其早期发育阶段的功能趋向，为鱼类发育学及鱼类分类学提供数据资料和有益参考。