基于SSR分子标记对西瓜杂交种早佳8424纯度的高通量鉴定

李寐华，杨 永，马新力，张学军，张 红，张永兵，伊鸿平

(新疆农业科学院哈密瓜研究中心,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】杂种优势已广泛应用于作物育种和农业生产中[1]。西瓜具有明显的杂种优势，主要表现为植株长势旺，果实品质好，产量高，抗病，抗逆性强等[2]，目前中国西瓜生产用种100%为杂交种[3]。杂交种子在生产过程中由于人工去雄不彻底、套帽夹花不严或机械混杂等，易导致掺入母本种子或外来杂种子[4,5]。杂交种子的纯度和真实性是种子质量的重要指标，是决定西瓜生产产量和品质的重要保障，关系到种子销售企业的品牌效益，杂交种子在销售前进行纯度和真实性鉴定,对满足制种单位种子快速准确鉴定有重要意义。【前人研究进展】目前随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphism DNA，RAPD)技术、相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和简单重复序列(simple sequence repeat，SSR) 技术等均已应用于西瓜杂交种纯度鉴定[3,6～7]，其中SSR标记因其分布均匀、共显性遗传、操作简单、稳定性好等在杂交种纯度鉴定方面的应用最为广泛。【本研究切入点】早佳8424西瓜是20世纪80年代培育的早熟、品质极佳且具有广泛生态适应性的露地、设施兼可种植的杂交种。2018年全国种植面积约26.67×104hm2(400万亩)。随着早佳8424西瓜品种种植面积不断扩大，种子需求量和制种面积不断增加，种子真实性和纯度的高通量快速准确鉴定成为制种单位的迫切需求。早佳8424西瓜种子纯度的传统鉴定主要依据田间形态学鉴定，即F1杂交种果皮为绿底墨绿色条带，而母本果皮为浅绿底核桃纹条带。传统鉴定需要品种特异农艺性状表现出来才能进行鉴别，较为费时费力，且受季节限制，易受环境因素影响。【拟解决的关键问题】利用早佳8424西瓜及其双亲筛选获得4对SSR共显性分子标记，在对单一标记优化的基础上，创建双重PCR扩增体系，将条带大小具有明显差异的分子标记组合应用于杂交种纯度鉴定，采用碱裂解法提取DNA法鉴定早佳8424西瓜杂交种子纯度和真实性。

1 材料与方法

1.1 材 料

西瓜品种早佳8424(F1)及其父母双亲T2(P2)、伊选(P1)共3份材料均由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA提取

改良CTAB法：取早佳8424西瓜及其父母双亲各10粒种子置于35℃培养箱中催芽约36 h至露出胚根即可，将10粒种子胚根等量混为1个样品，置于2 mL离心管中，然后加入1个约5 mm的钢珠和500 μL CTAB。利用罗氏MagNA Lyser组织匀浆仪以2 500 r/min震荡30 s，每管加入500 μL氯仿异戊醇，上下颠倒震荡50次，12 000 r/min离心3 min，吸取200 μL上清液于新的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇上下颠倒50次混匀，12 000 r/min离心3 min，用70%无水乙醇清洗2次，于80℃烘箱中约10 min蒸干，然后用200 μL ddH2O溶解。取2 μL DNA溶液，利用Q3000超微量分光光度计测定样品DNA浓度和纯度，取适量样品DNA母液统一稀释为20 ng/μL存放于-20℃冰箱中备用，DNA母液存放于-80℃冰箱中长期保存。提取大量样品时，为进一步提高效率，异丙醇沉降及70%无水乙醇清洗步骤可利用96孔PCR板结合排枪完成，离心时改用平板离心机4 680 r/min离心10 min，其它步骤同上。

碱裂解法：配置BufferA溶液(100 mM NaOH+2%Tween)和BufferB溶液(100 mM Tris-HCl+2 mM EDTA)。将待检测样品嫩叶或胚根置于96孔PCR板中，加入50 μL BufferA溶液，置于PCR仪中95℃温浴10 min中，加入50 μL BufferB溶液，上下颠倒50次混匀，取2 μL用于PCR扩增。

利用早佳8424母本伊选和父本T2从72对SSR引物中共筛选出4对呈现明显差异的分子标记。

1.2.2 SSR多态性引物的筛选

72对SSR引物由上海生物工程有限公司合成，具体引物信息详见T. Joobeur等[9]、范建光等[10]和李丽等[4]。以早佳8424及其双亲基因组DNA为模板进行PCR扩增，筛选出在早佳8424双亲间呈现多态性且早佳8424带型为双亲复合型的SSR引物。PCR反应体系10 μL，其中2×EasyTaqPCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技术有限公司) 5 μL，浓度为10 μM的正向引物和反向引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL，DNA模板1 μL。PCR扩增程序为94℃预变性 3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，28个循环；72℃终延伸5 min；PCR产物4℃ 保存。利用6%的聚丙烯酰胺凝胶170 V电泳1 h，通过银染法染色观察。表1

为保障多重PCR技术体系的建立，以早佳8424杂交种DNA为模板，对4个标记的最佳退火温度进行筛选。

1.2.3 西瓜杂交种早佳8424纯度的田间鉴定和SSR分子标记鉴定

西瓜杂交种早佳8424纯度的田间鉴定在新疆农业科学院哈密瓜研究中心亚尔乡基地进行。利用直径约5 mm的打孔器按照田间种植顺序依次取192株植株嫩叶置于96孔PCR板中，采用碱裂解法提取DNA，利用筛选出的SSR分子标记鉴定，并将鉴定结果同田间鉴定结果进行比较。

杂交种纯度=(1-杂种子数量/检测种子总数)×100%。

采集田间种植的早佳8424植株嫩叶，采用碱裂解法快速提取其DNA。利用WS27+MCPI-05组合对早佳8424杂交种纯度进行分子鉴定。

早佳8424西瓜果实呈圆球形，绿底果面并覆有墨绿条带，而其母本为浅绿底核桃纹条带，将早佳8424果面特征作为田间鉴定的最主要依据。

2 结果与分析

2.1 早佳8424杂交种纯度SSR鉴定标记筛选

研究表明,4对引物在早佳8424上的带型均呈现为双亲复合型,4对引物均可应用于早佳8424西瓜的杂交种纯度鉴定。引物BVWS00106和BVWS00333分别位于第5号和第9号染色体上，引物WS27和MCPI-05均位于第6号染色体上，4对引物PCR扩增片段大小均在100～300 bp。图1

表1 早佳8424杂交种纯度鉴定引物

Table 1 Primers used for genetic purity testing in hybrid Zaojia 8424 watermelon

引物名称Primer正向引物序列Forward primer反向引物序列Reverse primer染色体位置ChromosomeBVWS00106TGGCCTAGAAGATTATTGAGCTGCCATTATCACATGGCAGATAATGGAAAChr5BVWS00333TGTTGAGATTCTTTGATTTCAACTGTTGGGTCAAAGTATTTTTGCTTTTTChr9WS27TTCTCTTCATTCCCCCAAAATCACGGGTGAGGGAAAACGAGChr6MCPI-05ATTTCTGGCCCCAGTGTAAGGAACAACGCAACCACGTATGChr6

图1 4对SSR引物的PCR扩增图谱

Fig.1 SSR profile of Zaojia8424 and its parents amplified with the four primers

2.2 双重PCR扩增

研究表明,筛选出的4个标记根据扩增产物的大小可进行不同组合。60.2℃为最佳退火温度，退火温度小于60.2℃时4个标记均有不同程度的非特异性扩增，当退火温度高于60.2℃，PCR扩增产物产量随温度升高逐渐降低甚至无扩增产物。配制BVWS00106+BVWS00333、BVWS00106+WS27、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05、WS27+MCPI-05、BVWS00106+BVWS00333+WS27和BVWS00333+WS27+MCPI-05等7个组合在60℃退火温度下进行PCR扩增。BVWS00106+BVWS00333、BVWS00333+WS27、BVWS00333+MCPI-05和WS27+MCPI-05等4种组合能够用于早佳8424杂交种纯度鉴定，其它3种组合形式扩增失败。将不同引物组合进行多重PCR扩增时，会呈现竞争性扩增或选择偏好性扩增甚至相互抑制的现象，如BVWS00106+BVWS00333组合，两对引物PCR产物浓度均明显低于单一扩增；BVWS00333+WS27组合和BVWS00333+MCPI-05组合扩增时，BVWS00333引物PCR扩增均受到了抑制；将3对引物混合扩增时，均未能获得理想的PCR产物。图2,图3

注：1、2、3和4分别代表引物 VWS00106、BVWS00333、WS27和MCPI-05

Note:1, 2, 3 and 4 represent primer BVWS00106, BVWS00333, WS27 and McPi-05 ,respectively

图2 4对引物最佳退火温度的筛选

Fig. 2 Selection of optimum annealing temperature for the four SSR primers

图3 不同引物组合的多重PCR扩增

Fig. 3 Multiple PCR amplification for different primer combinations

2.3 早佳8424杂交种纯度SSR分子标记鉴定

研究表明,第49号植株带型与早佳8424母本带型一致，缺少其父本带型，因此,认定为杂种子，其它植株带型均为早佳8424双亲的复合带型，为真实的杂交种，该批样品杂交种纯度为99.5%。图4

图4 利用WS27+MCPI-05组合对早佳8424杂交种纯度的鉴定

Fig. 4 WS27+ McPi-05 combination was used to identify the hybrid purity of zaojia 8424

2.4 早佳8424杂交种纯度的田间鉴定

在田间共种植200株，经田间实地考察，第49株果实呈现为母本的果面特征，其余植株均为真实杂交种的果面特征，与分子鉴定结果完全一致，该批样品杂交种纯度为99.5%，利用SSR分子标记对早佳8424西瓜杂交种纯度进行鉴定是切实可行的。

3 讨 论

3.1 西瓜杂交种的生产及其纯度鉴定

西瓜一般为雌雄异花同株，偶尔也出现完全花和雄花同株。在西瓜杂交种生产过程中，要严格遵照杂交种生产技术规程，对易引起混杂的关键点进行严格把控，及时拔除制种田中的杂株、避免套冒夹花不严造成自交或串入其它花粉，避免在种子收获、精选过程中的机械混杂等，以保障杂交种子的纯度。目前用于西瓜杂交种纯度鉴定的方法主要分为两大类，利用形态学观察的传统田间鉴定和利用分子标记图谱信息的室内鉴定。早佳8424西瓜传统田间鉴定主要利用幼果期果皮附着条带来判断，果皮表面呈现为浅绿底核桃纹条带的即为杂种子。采用传统鉴定方法需要幼果膨大到一定阶段待果面特征显现出来才能准确鉴定，较为费时费力，当年收获的种子仅能在吐鲁番或南方通过设施大棚种植鉴定，甚至次年才能获得鉴定结果，鉴定周期长，成本高昂[11]，但由于形态学性状直观可见，该方法目前依然在广泛使用。利用分子标记对杂交种纯度鉴定，不受外界环境限制，简单快速，便于规模化、自动化流水作业[3,12～13]。尤其是SSR标记，因其对DNA质量要求低，共显性遗传，谱带信息清晰，稳定性好等优点，是目前开发应用最多，被认为比较理想的用于西瓜杂交种纯度鉴定的分子标记[12]。相比于形态学性状观察，SSR位点的差异不受人为选择倾向的影响，对品种的检测是一个综合客观的评价[4]，鉴定结果更为准确有效。

3.2 SSR分子标记鉴定体系及优化

SSR分子标记鉴定主要包括DNA提取、PCR扩增和电泳检测3个步骤。DNA快速高通量提取是关键限速环节。DNA提取主要包括试剂盒膜吸附洗脱提取、CTAB提取和碱裂解法提取3种方法。在大规模杂交种纯度鉴定时，试剂盒膜吸附洗脱提取法因成本高昂且不能有效结合排枪批量操作不宜采纳。碱裂解法避免了离心及更换离心管等操作，简便易行，大大提高了DNA提取效率，一般浓度相对较低，质量较差，但可以满足SSR-PCR扩增，可用于杂交种纯度SSR分子标记鉴定[10]。

单一分子标记PCR可有效区分混入杂交种中的母本种子，但双重或多重分子标记PCR可获得更为准确可靠的鉴定结果。刘子记等[3]建立了小型西瓜美月杂交种纯度双重PCR鉴定体系，与单一PCR相比，进一步降低了检测时间和费用。研究共筛选出4对可用于早佳8424西瓜杂交种纯度鉴定的引物，并获得4种组合进行双重PCR，当某一引物出现问题时，可有效替补。在PCR过程中需要针对不同的引物筛选其最佳退火温度，避免非特异性扩增对鉴定结果造成干扰，不同DNA聚合酶及PCR扩增体系都会影响PCR扩增的特异性[13]，当更换不同品牌的PCR mix时，要对PCR扩增体系及PCR扩增程序重新进行探索修正，并在鉴定过程尽可能避免更换试剂。

4 结 论

以早佳8424及其双亲为试验材料，从72对SSR引物中筛选获得4对在早佳8424上表现为双亲互补带型的引物，分布于3条染色体上，片段大小约100～300 bp。将扩增片段大小不同的引物进行双重或多重PCR扩增，获得4个双重PCR组合。将SSR分子标记鉴定同田间传统鉴定进行比较，结果完全一致，SSR标记及其组合切实可用于西瓜杂交种早佳8424纯度鉴定，效率高，操作简便，适于室内高通量流水作业。