沙果渣膳食纤维超高压处理条件优化及其微观结构表征

朱 丹，朱立斌，牛广财,3*，苗欣月，魏文毅,3，王 坤,3

1黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院；2黑龙江八一农垦大学食品学院；3黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，大庆 163319

膳食纤维是指植物类食品中不被人体胃肠道消化酶消化，但能被人体胃肠道系统内定殖的部分微生物酵解或利用的，特指非淀粉性多糖类和木质素的总称。根据其溶解性的不同，一般分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)[1]。目前，制备膳食纤维食品的主要来源是各种农作物加工后的废弃物，如大豆皮渣、燕麦麸皮、米糠、麦麸和黑豆皮等[2,3]，膳食纤维中SDF含量是影响膳食纤维生理功能的重要因素。美国学者Richard.E和Donald.J建议平衡的DF组成要求SDF占TDF总量的10%以上，而一般的膳食纤维不具备较好的加工特性、生理活性和保健功能，其可溶性纤维比例都很低，只有3%～4%。高品质膳食纤维中可溶性成分含量应该达到10%以上。因此，采用不同的方法对膳食纤维进行改性，使其SDF比例提高，具有更高的持水性、膨胀力和更强的吸附作用等成为研究的热点。常用的膳食纤维改性方法有化学方法、生物技术方法、物理方法以及多种方法组合等。化学法是利用酸碱等化学试剂处理膳食纤维，改变膳食纤维结构，使纤维类大分子转化为非消化性多糖，该方法虽方便快捷，但反应复杂、时间长、污染环境，已逐渐被其他方法所取代[4]；生物改性技术采用的方法有酶法和发酵法[5]，目前应用的膳食纤维改性的酶主要有木聚糖酶、纤维素酶等。生物改性条件温和，无化学溶剂污染，改性后产品中可溶性成分增多，持水力、膨胀力和吸附性等生物活性功能提高，但是，生物技术方法成本较高，仍需进一步优化工艺；物理方法是使纤维物质发生破碎、膨化，进而改变其理化性质，该方法操作简单，可用于开发新型功能性产品。主要有螺杆挤压技术、蒸汽爆破技术、超高压技术(ultra high pressure，UHP)、超声波处理(ultrasonic wave，UW)和超微粉碎技术等[6,7]。其中，超高压技术处理是一个纯物理过程，是将物料用超高压(一般是100～1000 MPa)处理，物料在液体介质中体积被压缩，超高压产生的极高的静压能使氢键、离子键和疏水键等非共价键发生变化，从而使大分子物质改性或变性[3]。

沙果(MalusasiaticaNakai)为蔷薇科植物林檎的果实，是东北地区夏秋季节大量上市的地产水果。在企业生产浓缩汁时产生了大量的废渣，引起了严重的环境污染与资源的浪费，已成为困扰浓缩汁生产企业的一大难题。目前，尚未见到有关超高压处理对沙果渣膳食纤维影响的研究。因此，本研究以沙果渣为原料，研究超高压处理对沙果渣中SDF/TDF的影响，并借助扫描电镜和红外光谱等方法分别对其微观结构与官能团进行表征，以期为沙果渣高品质膳食纤维的生产及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙果渣由黑龙江省大庆森阳果蔬食品科技有限公司提供，60 ℃烘干，粉碎；食用级大豆油，黑龙江九三油脂有限公司；无水乙醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯二甲醛、盐酸、氢氧化钠、蒽酮、无水乙酸钠等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

FW80型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；101-2AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；AR2140电子天平，奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；HPP600MPa超高压设备，包头科发高压科技有限公司；电子扫描电镜，JSM-6490LV，日本电子株式会社；Spectrum 2000型傅立叶红外光谱分析仪，美国PE公司；TDL-S-A离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 沙果渣膳食纤维(DF)的制备

将干沙果渣粉碎后过60目筛，以1∶15料液比加入80%乙醇，对样品浸提2次，离心分离后，继续用丙酮洗涤沉淀，挥干后将沉淀在干燥箱中低温干燥。然后按一定料液比，用水将预处理后的沙果渣粉调成悬浊液，装入超高压包装袋，调整设备的压力和处理时间，进行超高压实验。处理结束后进行抽滤，滤渣经干燥得到IDF；收集滤液，于60 ℃下减压浓缩后，加入4倍体积无水乙醇密闭，静置过夜，再次抽滤，将抽滤后的沉淀物干燥得到SDF[8]。

1.3.2 单因素实验

超高压处理沙果渣在室温下进行，调节料水比后，装入超高压包装袋，设置设备的压力和处理时间，进行超高压处理实验。

1.3.2.1 压力对SDF/TDF的影响

将处理后的沙果渣以料液比1∶15(g/mL)浸润，常温下放置2 h，分别在100、200、300、400、500 MPa压力下处理15 min，干燥后测定SDF/TDF。

1.3.2.2 料液比对SDF/TDF的影响

将处理后的沙果渣分别以不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)浸润，常温下放置2 h，然后在300 MPa压力下处理10 min，干燥后测定SDF/TDF。

1.3.2.3 处理时间对SDF/TDF的影响

将处理后的沙果渣以料液比1∶20(g/mL)浸润，常温下放置2 h，在300 MPa压力下分别处理5、10、15、20、25 min，干燥后测定SDF/TDF。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验结果基础上，采用中心组合Box-Behnken设计方案，以SDF/TDF为响应值(Y值/%)，研究料液比、压力和时间各因素对沙果渣膳食纤维中SDF/TDF的影响，因素水平编码见表1。

1.3.4 膳食纤维理化性质测定

1.3.4.1 膳食纤维含量测定

不溶性膳食纤维(IDF)和可溶性膳食纤维(SDF)的测定：参照AACC32-06的方法测定。SDF占TDF的比例按如下公式计算：

SDF/TDF=SDF/(SDF+IDF)×100%

1.3.4.2 持水力(WHC)的测定

参照Esposito等[9]方法，准确称取沙果膳食纤维干样(m1)1.0 g置于50 ml离心管(m0)中，加入10 mL蒸馏水浸泡，摇匀，室温下静置1 h，于5000 rpm离心20 min，弃去上清液，离心管残留水分用滤纸吸干后，称量离心管与样品质量(m2)，计算WHC。

WHC(g/g)=(m2-m0-m1)/m1

式中，m1—样品干样质量(g)；m2为离心管与吸水样品的总质量(g)；m0为离心管质量(g)。

1.3.4.3 持油力(OHC)的测定

参考Wang等[10]方法略有改动，准确称取沙果膳食纤维干样(m1)1.0 g置于50 ml离心管(m0)中，加入10 mL大豆油摇匀，室温下静置1 h，于5000 rpm离心20 min，小心弃去上层油后，称量离心管与样品质量(m2)。计算OHC。

OHC(g/g)=(m2-m0-m1)/m1

式中，m1—样品干样质量(g)；m2为离心管与吸附油脂样品的总质量(g)；m0为离心管质量(g)。

1.3.4.4 膨胀力(SC)测定

参考Robertson等[11]方法略有改动，准确称取沙果膳食纤维干样0.5 g置25 mL刻度试管中，读取样品干样体积(v0)，加入20 mL蒸馏水，震荡摇匀，于室温下放置24 h，测定其膨胀体积后体积(v1)，计算SC。

SC(mL/g)=(v1-v0)/ m

式中，v1为样品膨胀后体积(mL)；v0为样品干样体积(mL)；m为样品干样质量(g)。

1.3.5 膳食纤维功能特性的测定

1.3.5.1 膳食纤维阳离子交换能力的测定

参考Zhang[12]方法，称取0.5 g膳食纤维干样，加0.1 mol/L的盐酸20 mL，摇匀，室温放置过夜，滤纸过滤后用蒸馏水反复清洗除去多余的盐酸。处理后的样品中加入5%NaCl溶液100 mL，磁力搅拌30 min，以0.5%的酚酞乙醇溶液为指示剂，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定，用蒸馏水代替HCl做空白实验，重复测定3次。计算阳离子交换能力(cation exchanging capacity，CEC)。

CEC=(V0-V1)×0.1/m

式中，V0为样品消耗的NaOH体积(mL)；V1为空白消耗的NaOH体积(mL)；m为样品干样质量(g)；0.1为NaOH浓度(mol/L)。

1.3.5.2 膳食纤维对胆固醇吸附量的测定

参考Huang[13]方法，取市售鲜鸡蛋去蛋清留蛋黄，加入9倍质量的蒸馏水充分搅打成均匀乳液。分别称取1.0 g膳食纤维样品于100 mL的锥形瓶中，向每个锥形瓶中加入25.0 g稀释的蛋黄液并搅拌均匀，在37 ℃下振荡2 h，于5 000 rpm转速下离心20 min，吸取上清液，采用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量。计算膳食纤维对胆固醇吸附量。

膳食纤维对胆固醇的吸附量(mg/g)=

(W2-W1)/W

式中，W为膳食纤维干样质量(g)；W2为吸附前蛋黄液中胆固醇含量(mg)；W1为吸附后上清液中胆固醇含量(mg)。

1.3.5.3 膳食纤维吸附葡萄糖能力的测定

参考Huang[13]方法，称取1.0 g膳食纤维样品于250 mL的锥形瓶中，加入100 mL质量浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液，混匀后在37 ℃下振荡6 h，5 000 rpm转速下离心20 min，吸取上清液，采用蒽酮法测定上清液中葡萄糖含量。

膳食纤维对葡萄糖的吸附量(mg/g)=

(C0-C1)×V/M

式中，M为膳食纤维干样质量(g)；C0为吸附前葡萄糖质量浓度(μg/mL)；C1为吸附后上清液中葡萄糖质量浓度(μg/mL)；V为吸附液体积(mL)。

1.3.6 沙果渣膳食纤维微观结构表征

1.3.6.1 扫描电镜

将超高压处理前后的沙果渣膳食纤维样品干燥至恒重，取适量进行粘台，采用离子溅射方法将其表面镀金，在加速电压12.5 kV条件下对已制备好的样品进行扫描电镜观察。

1.3.6.2 傅里叶红外光谱扫描

称取超高压处理前后的沙果渣膳食纤维样品各2.00 mg于玛瑙研钵中，分别与200 mg KBr粉末充分混合并研磨均匀压片，立即进行红外光谱扫描，扫描范围为4 000～500 cm-1。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2007作图，响应面试验的设计和分析用Design-Expert 8.0软件进行处理。利用SPSS 17.0软件进行两个样本独立T检验并对实验数据进行处理和分析，结果以平均值±标准差的形式表示。数据多重比较采用Duncan 法分析0.05水平上均值的显著差异。

2 结果与分析

2.1 压力对沙果渣SDF/TDF的影响

由图1表明，增加压力改变了可溶性膳食纤维在沙果渣总膳食纤维中的含量。但是，在作用压力从100 MPa增加至200 MPa时，SDF/TDF增加幅度较大，沙果渣中可溶性膳食纤维的含量提高较快；在由200 MPa增加至300 MPa时增加幅度变缓，这可能是结构较致密的大分子组分如纤维素，半纤维素，木质素等的糖苷键在该压力下发生断裂，使SDF/TDF增加；当压力超过300 MPa时，SDF/TDF呈下降趋势。因此，从实际情况考虑，300 MPa为适宜采用的压力。

图1 压力对SDF/TDF的影响Fig.1 Effect of pressure on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.2 料液比对沙果渣SDF/TDF的影响

由图2可知，当料液比为1∶20时，SDF/TDF达到最大，之后呈下降趋势。这是因为料液比在1∶20时，由于300 MPa超高压处理产生的空穴作用、碰撞作用及剪切作用对物料的作用较强，大分子变为小分子，致密结构变得疏松，使可溶性成分被释放出来。再继续增加料液比时，SDF/TDF呈下降趋势，说明料液比过大会导致单位体积底物含量偏低。

图2 料液比对沙果渣SDF/TDF的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.3 处理时间对SDF/TDF的影响

由图3可知，随着超高压处理时间的延长，SDF/TDF呈现上升趋势。在15 min的保压条件下，SDF/TDF达到最大值21.67%。之后随着时间的延长则开始下降，可能是由于时间过长，SDF组分中的部分果胶在水溶液中被氢离子分解而降低SDF的得率[14]。表明一定时间的超高压处理，能够在一定程度上使沙果渣总膳食纤维中SDF增加，在料液比1∶20的情况下，300 MPa压力下处理15 min时较为合适。

图3 处理时间对SDF/TDF的影响Fig.3 Effect of processing time on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.4 响应面试验结果分析

应用Design-Expert 8.0软件，对表2中试验数

据进行二次多项拟合，得到的回归方程为：

Y=21.66-0.058A+0.080B-0.020C+0.010AB+0.83AC+0.25BC-0.34A2-0.68B2-1.32C2。

表2 响应面试验结果与分析

表3 二次多项模型方差分析表

续表3(Continud Tab.3)

方差来源Source平方和Sum of squares自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value显著性SignificanceBC0.2510.256.640.049 6*A20.4410.4411.570.019 2*B21.7211.7245.830.001 1**C26.4716.47171.86< 0.000 1**残差Residual0.1950.038失拟项Lack of fit0.1730.0576.600.134 5纯误差Pure error0.01728.633E-003总和Total11.1814

注：*表示P<0.05差异显著；**P<0.01差异极显著。

Note:*shows significant differences (P<0.05);**means extremely significant differences (P<0.01).

同时，利用Design Expert 软件作出两因素交互作用的响应面图及其等高线图，结果见图4。响应面的曲面开口向下，随着每个因素变量的增加，响应值也增加，当响应值达到最大值后，随着各因素的继续增加，响应值则逐渐降低，说明最佳点在考察的范围内。等高线的形状可反映交互效益的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由图4也可看出，AB交互作用不显著，AC、BC间交互作用显著。

图4 料液比、压力、时间交互作用对SDF/TDF值影响的响应面及等高线图Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between solid-liquid ratio,pressure and processing time on SDF/TDF

根据Design-Expert 8.0软件优化分析，在料液比1∶19.30 g/mL，压力304.93 MPa，时间14.76 min条件下，模型预测沙果渣膳食纤维中SDF/TDF值21.66%。为验证响模型预测结果的可靠性，结合实际操作的方便性，在料液比1∶19.30 g/mL，压力300 MPa，时间15 min条件下，进行3次重复验证试验，测得的SDF/TDF值分别为：21.76%、21.70%和21.67%，平均值为21.71%。与理论预测值相比，误差为0.23%，即与预测值相符。

2.5 超高压处理前后沙果渣膳食纤维理化性质的变化

沙果渣膳食纤维超高压处理前后理化性质的变化见表4。由表4可知，经过超高压处理后，沙果渣膳食纤维的持水力、持油力和膨胀力均有了显著的提高(P<0.05)。其中，持水力由6.67 g/g升至7.81 g/g，提高了17.09%；持油力由7.34 g/g升至8.03 g/g，提高了9.40%；膨胀力由6.34 mL/g升至7.20 mL/g，提高了13.56%。这可能与超高压处理后样品的内部结构发生变化有关。

表4 处理前后理化性质的变化

2.6 超高压处理前后沙果渣膳食纤维功能特性的变化

膳食纤维结构中含有弱酸性的羧基、羟基等侧链基团，可以与阳离子可逆交换，类似阳离子树脂的作用。由表5可知，经过超高压处理后，沙果渣膳食纤维的阳离子交换能力为0.78 mmol/g，显著高于处理前的样品(P<0.05)；膳食纤维还具有吸附或包埋人体内胆固醇的能力，可降低血浆胆固醇水平，减少机体对胆固醇的吸收。超高压处理后沙果渣膳食纤维对胆固醇吸附的吸附量为14.31 mg/g，显著高于处理前的样品(P<0.05)，可能是超高压处理后沙果渣膳食纤维中可溶性膳食纤维提高所致；膳食纤维也具有抑制葡萄糖扩散的功效，可降低血液中葡萄糖的含量，有效控制血糖指数[15]。超高压处理的沙果渣膳食纤维吸附葡萄糖能力显著高于处理前的样品(P<0.05)，表明膳食纤维的对葡萄糖吸收能力与其可溶性膳食纤维的含量及物理结构有关的结果相一致。主要是由于可溶性膳食纤维与水接触后产生的凝胶状物体将葡萄糖分子包裹其中，并且膳食纤维疏松的网状结构也会减缓葡萄糖分子在食品体系中的扩散速率[16]。

表5 处理前后功能特性的变化

2.7 超高压处理前后沙果渣膳食纤维的微观结构分析

沙果渣膳食纤维超高压处理前后其结构的扫描电镜图见图5。由图5可知，经超高压处理后的沙果渣膳食纤维样品与未经处理样品相比，微粒呈现不规则形状，表面孔隙较多，组织结构变得更加疏松多孔，沟壑、网状及层状结构增多。这与超高压处理后沙果渣膳食纤维的持水力、持油力、膨胀力增加的情况相符合。而未处理样品表现为微粒大小不一，表面光滑，结构紧凑，主要呈不规则形状的碎石状，结构较致密的排列在一起。这是由于超高压处理过程中产生了极高的静压及伴随的气穴、摩擦、冲击等压力，不但能影响细胞的形态，还能使形成生物大分子立体结构的氢键、离子键和疏水键等非共价键发生变化，这些结构的变化对膳食纤维的理化特性发挥着至关重要的作用[17]。

图5 超高压处理前(A)和处理后(B)沙果渣膳食纤维的SEM图(放大300倍)Fig.5 SEM graph of dietary fiber from M.asiatica residue of (A) before treatment,(B) after treatment by UHP(×300)

2.8 超高压处理前后膳食纤维的红外光谱分析

沙果渣膳食纤维超高压处理前后样品的红外光谱图见图6。由图6可以看出，在3 425 cm-1附近出现较大的宽吸收峰，这是由O—H羟基的伸缩振动引起的，说明沙果渣膳食纤维可能存在着较多的羟基及结合水分子[18]。2 921.49和2 920.92 cm-1处的吸收峰为C—H的伸缩振动峰[19]；1 734.61和1 735.81 cm-1处的吸收峰是半纤维素的特征吸收峰，为木聚糖C=O伸缩振动引起的[20]；在1 633.43和1 631.44 cm-1处的吸收峰是由C=O伸缩振动引起的，说明沙果渣膳食纤维中可能存在糖醛酸[21]；897.34 cm-1处的吸收峰表明沙果渣膳食纤维单糖含有β型吡喃糖C—H的弯曲振动[22]。

图6 超高压处理前(A)和处理后(B)沙果渣膳食纤维的红外光谱图Fig.6 The infrared spectra of dietary fiber from M.asiatica residue of (A) before treatment,(B) after treatment by UHP

图6的红外光谱分析表明，沙果渣纤维中有纤维素、半纤维素和木质素的特征吸收峰。在波长为3 425.12、2 920.92、1 631.44和1 059.02 cm-1处有较大的区别，1 631.44 cm-1为木质素分子结构附近的吸收峰，1 059.02 cm-1(C=O伸缩振动)处的吸收峰为纤维素的特征吸收峰。由于分子间氢键作用力的破坏，超高压处理后样品的谱带强度减小并变窄，这可能是因为超高压处理使部分木质素和纤维素转变为可溶性膳食纤维，而导致SDF含量增加所致。

3 结论

本试验利用Design Expert软件，采用响应面法建立了超高压处理沙果渣膳食纤维对SDF/TDF的数学模型，拟合性好。同时，优化了超高压处理的料液比、压力和时间等条件，最优条件为处理压力300 MPa，时间15 min，料液比1∶19.30(g/mL)，该条件下沙果渣膳食纤维的可溶性膳食纤维含量、持水力、持油力、膨胀力、阳离子交换能力、对胆固醇吸附量、吸附葡萄糖能力分别为21.71%、7.81 g/g、8.03 g/

g、7.20 mL/g、0.78 mmol/g、14.31 mg/g和8.20 mg/g，其理化性质均优于未经超高压处理的沙果渣膳食纤维。经过扫描电镜观察和红外光谱分析超高压处理后的沙果渣膳食纤维样品，呈现不规则形状，表面孔隙增多，组织结构变得更加疏松多孔，沟壑、网状及层状结构增多，与处理后其理化性质的改善完全吻合。