盐酸去氢骆驼蓬碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡及自噬的影响

西仁阿依·西热甫，雷秀英，张 瑜，伊力亚斯·艾萨，木塔力甫·艾买提，5，陈 倩，冯学召，李 飞，4，米 娜

（新疆医科大学1.药学院，2.第一附属医院临床医学研究院，3.基础医学院，5.中心实验室，新疆乌鲁木齐 830011；4.中国药科大学国家重点实验室，江苏 南京 210009）

神经母细胞瘤是儿童常见的颅外实体瘤，属于胚胎性恶性肿瘤，在全世界儿童实体肿瘤发病率中位居第二，仅次于中枢神经系统肿瘤，占所有儿童恶性肿瘤总发病率的8%～10%［1-2］。神经母细胞瘤是一种复杂的疾病，从转移扩散到自发消退，其临床过程不尽相同，1岁以上患儿出现转移性病灶的几率较高，而1岁以下患儿却往往呈现肿瘤自发消退的趋势［3-4］。该病治愈率在低风险患儿中＞90%，而在高风险者中则＜50%，呈现极大差异［5］。

盐酸去氢骆驼蓬碱（harmine hydrochloride，HMH）是自然界中丰富存在的β-咔啉类生物碱类去氢骆驼蓬碱（harmine，HM）的盐酸盐。研究表明，HM具有明显的抗肿瘤活性，包括在体外实验中，抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭［6］，抑制黑素瘤细胞血管的形成［7］，阻滞结肠癌细胞周期［8］，促进胃癌细胞凋亡［6，9］等；以及在体内实验中抑制多种肿瘤的生长，如黑素瘤［7］、肺癌［10］、乳腺癌［11］和肝癌［12］等。研究表明，HM能通过血脑屏障，在神经系统富集［13］。到目前为止，HM对人神经母细胞瘤生存的影响及其相关机制研究报道较少。因此，本文研究了HMH对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的影响，并初步探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和主要仪器

HMH（批号：H0002，纯度＞98%），上海梯希爱化成工业发展有限公司，使用前用DMSO配成40 mmol·L-1的母液，-20℃保存。DMEM高糖培养基、PBS磷酸盐缓冲液和青-链霉素，美国Hyclone公司；胎牛血清，以色列BI公司；DMSO、MTT、兔抗人胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3B（microtubuler-associated protein light chain 3B，LC3B）、P62和β肌动蛋白单克隆抗体，及3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Hoechst-33342，美国Sigma公司；兔抗人Bax、Bcl-2、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapa⁃mycin，mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）单克隆抗体，英国Abcam公司；兔抗人蛋白激酶B（pro⁃tein kinase B，Akt）和p-Akt单克隆抗体，美国CST公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体，美国Southern Biotech公司。

超净化工作台、CO2孵育箱和酶标仪，美国Thermo公司；倒置光学显微镜，宁波舜宇仪器公司；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；激光共聚焦显微镜，日本Nikon公司；小型垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞和细胞培养

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国科学院细胞库。细胞于含10%胎牛血清、1%青链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM高糖培养液中，在5% CO237℃的孵育箱中培养。每天倒置光学显微镜下观察细胞状态，待细胞长至80%～90%融合度进行传代。

1.3 MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率

取对数生长期的SH-SY5Y细胞消化、计数并稀释成5×107L-1的单细胞悬液，每孔200 μL，接种至96孔板培养24 h。细胞分药物组和细胞对照组，每组6个复孔。药物组加入含HMH 10，20，40，80和 160 μmol·L-1的细胞培养液，细胞对照组加入等量DMSO（体积分数≤0.1%）。培养24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，置孵育箱继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪在490 nm处测定吸光度（A490nm）值。细胞存活率（%）=（药物组A490nm/细胞对照组A490nm）×100%。

1.4 克隆形成实验检测SH-SY5Y细胞增殖

取对数生长期的SH-SY5Y细胞消化、计数并稀释成5×104L-1的单细胞悬液，每孔1 mL接种至12孔板，培养至贴壁。细胞分药物组和细胞对照组，药物组加入含HMH 2和4 μmol·L-1的细胞培养液，细胞对照组加入等量DMSO（体积分数≤0.1%）培养14 d，细胞长至在日光灯下肉眼可观察到白色细胞团时，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定，0.05%结晶紫染色，观察紫色细胞克隆团的大小及数量，并采集图像。克隆形成率（%）=形成克隆数目/接种细胞数目×100%。

1.5 Hoechst33342/PI染色法检测SH-SY5Y细胞凋亡

取对数生长期的SH-SY5Y细胞消化、计数并稀释成2×108L-1的单细胞悬液，每孔500 μL接种至4孔玻底培养皿培养24 h。细胞分组给药同1.3，培养24 h后，加入Hoechst33342染色液和PI染色液，置孵育箱37℃孵育30 min，PBS洗涤，加500 μL完全培养液，用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况，并采集图像。

1.6 Western印迹法检测Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、LC3B-Ⅱ、P62蛋白水平及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取对数生长期的SH-SY5Y细胞消化、计数并稀释成2×108L-1的单细胞悬液，每孔2 mL接种至6孔板培养24 h。在检测Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3、LC3B-Ⅱ和P62蛋白水平时，细胞分组给药同1.3；在检测联用自噬抑制剂3-MA后LC3B-Ⅱ蛋白水平时，细胞分为药物组、模型加药物组和细胞对照组，药物组加入含HMH 40 μmol·L-1的细胞培养液、模型加药物组加入含HMH40μmol·L-1和3-MA 5 mmol·L-1的细胞培养液，细胞对照组加入等量DMSO（体积分数≤0.1%）；在检测Akt和mTOR磷酸化水平时，细胞分药物组和细胞对照组，药物组加入HMH 40 μmol·L-1的细胞培养液，细胞对照组加入等量DMSO（体积分数≤0.1%）。培养24 h后收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离总蛋白，半干转法转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗5 min×3次，加入一抗〔Bax（1∶1000）、Bcl-2（1∶2000）、胱天蛋白酶3（1∶2000）、活化的胱天蛋白酶3（1∶2000）、LC3B（1∶5000）、P62（1∶5000）、Ak（t1∶5000）、p-Akt（1∶5000）、mTOR（1∶5000）、p-mTOR（1∶5000）和β肌动蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育过夜。PBST洗10 min×3次，加入二抗（1∶5000），常温孵育1 h。PBST洗10 min×4次，显影，扫描，采用Image J软件对蛋白条带进行积分吸光度（integrated absor⁃bance，IA）值分析。以目标蛋白与内参蛋白条带IA值的比值表示目标蛋白的相对表达水平；以磷酸化蛋白与总蛋白条带IA值的比值表示蛋白磷酸化水平。

1.7 统计学分析

各组实验均独立重复至少3次。采用SPSS 21.0统计软件及Graphpad Prism 6.0软件进行统计分析和制图，结果数据用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HMH对SH-SY5Y细胞存活率的影响

与细胞对照组相比，不同浓度的HMH作用24 h后，在 20～160 μmol·L-1浓度范围内对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞存活均有显著抑制作用（P＜0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of harmine hydrochloride（HMH）on via⁃bility of SH-SY5Y cells by MTT assay

2.2 HMH对SH-SY5Y细胞克隆形成的影响

与细胞对照组相比，HMH 2 和 4 μmol·L-1组SH-SY5Y细胞克隆形成率显著降低（P＜0.01），分别为（75±5）%和（31±3）%（图1）。

Fig.1 Effect of HMH on cloning formation of SH-SY5Y cells.The SH-SH5Y cells were treated with HMH 2 and 4 μmol·L-1 for 14 d.B was the qualitive result of A.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 HMH对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

细胞对照组蓝色细胞核色泽均匀，饱满，呈淡蓝色，红色荧光微弱。当HMH 10～160 μmol·L-1作用24 h后，随着药物浓度的增加蓝色荧光增强，细胞核皱缩、分叶，形成凋亡小体，边缘不清晰，最终碎裂，而红色荧光也随药物浓度的增加逐渐增强，死亡细胞增多（图2）。

Fig.2 Effect of HMH on SH-SY5Y cells apoptosis by Hoechst33342/PI staining（×600）.See Tab.1 for the cell treatment.The arrows show the chromatin condensation，nuclear fragmentation，cell shrinkage and necrosis.

2.4 HMH对Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3和活化的胱天蛋白酶3蛋白表达的影响

与细胞对照组相比，HMH作用于SH-SY5Y细胞24 h后，在20～160 μmol·L-1浓度范围内，SH-SY5Y细胞凋亡标志蛋白Bax/Bcl-2的比值显著增加（P＜0.05），在40～160 μmol·L-1浓度范围内，活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3的比值显著增加（P＜0.05）（图3）。

Fig.3 Effect of HMH on protein expressions of Bax，Bcl-2，caspase 3 and cleaved-caspase 3 in SH-SY5Y cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B and C were the semi-qualitive results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 HMH对LC3B-Ⅱ和P62表达的影响

与细胞对照组相比，不同浓度的HMH作用于SH-SY5Y细胞24 h后，在 20～160 μmol·L-1浓度范围内，SH-SY5Y细胞自噬标志蛋白P62的相对表达水平显著减少（P＜0.01），LC3B-Ⅱ的相对表达水平显著增加（P＜0.01）（图4）。

Fig.4 Effect of HMH on protein expressions of microtu⁃buler-associated protein light chain 3B-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）and P62 in SH-SY5Y cells by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-qualitive result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 HMH单用或与3-MA联用对自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ表达的影响

药物作用于SH-SY5Y细胞4 h后，与细胞对照组相比，HMH 40 μmol·L-1单独处理组及同时给予HMH 40 μmol·L-1和自噬抑制剂 3-MA 5 mmol·L-1组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达水平均无显著变化。而药物作用24 h后，与细胞对照组相比，HMH 40 μmol·L-1单独处理组 SH-SY5Y 细胞 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达水平显著增加（P＜0.01）；与HMH 40 μmol·L-1单独处理组相比，同时给予 HMH 40 μmol·L-1和3-MA 5 mmol·L-1组细胞LC3B-Ⅱ蛋白相对表达水平显著减少（P＜0.05）（图5）。

Fig.5 Effect of HMH on LC3B-Ⅱprotein expression in SH-SY5Y cells by Western blotting.The SH-SY5Y cells were treated with HMH 40 μmol·L-1or HMH 40 μmol·L-1+3-MA 5 mmol·L-1for 4 or 24 h，respectively.B was the semiqualitive result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with HMH group.

2.7 HMH对Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影响

与细胞对照组相比，HMH 40 μmol·L-1作用于SH-SY5Y细胞24 h后，Akt蛋白的表达水平无显著变化，mTOR蛋白的表达水平有所增加但没有显著性差异，p-Akt和p-mTOR蛋白的表达水平减少，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值显著降低（P＜0.05）（图6）。

Fig.6 Effect of HMH on phosphorylation levels of protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in SH-SY5Y cells by Western blotting.The SH-SY5Y cells were treated with HMH 40 μmol·L-1for 24 h.B was the semi-qualitive results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

3 讨论

MTT实验及克隆形成实验结果显示，HMH在低浓度时即表现出显著的SH-SY5Y细胞增殖抑制作用，且随着药物浓度的增加，细胞存活率降低。Hoechst33342/PI染色结果显示，HMH 20 μmol·L-1时细胞核开始皱缩，分叶，随着药物浓度的增加，细胞核内形成凋亡小体，细胞核碎裂，死亡细胞逐渐增多。

凋亡途径始终是抗肿瘤药物起作用的最佳途径［14-15］。凋亡途径分内源性凋亡和外源性凋亡，内源性凋亡途径又称线粒体凋亡途径［16］。本研究检测了内源性凋亡途径关键蛋白Bax和Bcl-2，发现Bax蛋白的表达量随药物浓度的增加而增加，Bcl-2蛋白的表达水平随药物浓度的增加而减少，Bax/Bcl-2的比值增加。此外，胱天蛋白酶家族是参与细胞凋亡的关键家族，分为启动子蛋白（如胱天蛋白酶8和9）和执行子蛋白（如胱天蛋白酶3，6和7）。其中胱天蛋白酶3的剪切是凋亡发生的标志性过程，同时它也是Bax和Bcl-2的下游蛋白［17］。本研究检测发现，活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3的比值增加，说明HMH能够启动内源性凋亡途径。

自噬在肿瘤的发生和发展过程中是一把“双刃剑”。自噬能抑制肿瘤细胞的发育，过度自噬可导致肿瘤细胞自噬性死亡，相反，自噬也可以提高肿瘤细胞对应激的耐受性，维持肿瘤细胞的存活［18-19］。本研究检测了自噬标志性蛋白LC3B-Ⅱ和P62的表达。LC3B蛋白有2种形式LC3B-Ⅰ与LC3B-Ⅱ，当自噬发生时LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ，参与自噬体的形成［20］。本研究的结果显示，LC3B-Ⅱ相对表达水平随药物浓度的增加而增加，P62蛋白的相对表达水平随药物浓度的增加而减少，说明HMH能够诱导SH-SY5Y细胞自噬。联合应用自噬抑制剂3-MA 4 h后，HMH单独给药组LC3B-Ⅰ至LC3B-Ⅱ的转化不明显；而联合应用3-MA 24 h后，HMH单独给药组LC3B-Ⅰ至LC3B-Ⅱ的转化明显，且联合应用3-MA组LC3B-Ⅱ相对表达水平减少，说明HMH诱导SH-SY5Y细胞自噬具有时间依赖性。然而，这种自噬对肿瘤细胞具有保护作用还是协同细胞凋亡发挥对SH-SY5Y细胞的抑制作用尚不明确，还需进一步研究。

Akt为PI3K/Akt/mTOR信号通路的中枢蛋白，参与细胞增殖、迁移、凋亡和自噬等多种生物过程［21］。Akt在多种肿瘤细胞中被异常激活，参与肿瘤的发生与发展［22］。mTOR为Akt的下游蛋白，是参与细胞自噬过程的重要负调控因子［23］。有研究表明，HM能通过抑制Akt/mTOR信号通路发挥抗胃癌作用［9］。本研究发现，HMH可抑制Akt/mTOR的磷酸化水平，说明HMH通过负调控Akt/mTOR通路诱导SH-SY5Y细胞凋亡与自噬。

综上所述，HMH能通过启动肿瘤细胞内源性凋亡途径抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖，同时诱导细胞自噬。该作用通过抑制Akt/mTOR信号通路实现。