氨肽酶P2在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

曾瑶 徐惠丽 王梦漪 张子龙

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肿瘤科（武汉430014）；2 华中科技大学同济医学院附属荆州医院（荆州434020）

结直肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤[1-3]，在我国的发病率和死亡率均高居所有恶性肿瘤的第5位，严重威胁国民的生命健康[4-5]。结直肠癌的发生发展是一个多因素参与的多步骤复杂过程，其中，原癌基因的激活和抑癌基因的表达失调扮演着重要的角色[6-10]。XPNPEP2（也称为氨肽酶P2 或APP2）作为一种膜结合金属蛋白酶，由位于Xq25 染色体上的人XPNPEP2 基因编码，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1位点的氨基酸残基，如Arg-Pro-Pro 等[11-14]。既往关于XPNPEP2生物学功能的研究主要集中在心血管疾病方面，其可参与血管舒张剂缓激肽的代谢过程[13]及ACEI 药物引起的血管性水肿[14]。最近研究发现，XPNPEP2在恶性肿瘤的发生发展中也发挥着重要作用。相关研究表明，XPNPEP2在宫颈癌[15]、前列腺癌[16]及胃癌[17]中异常表达，且其高表达与肿瘤的侵袭转移及患者不良预后密切相关[15，17]。然而，关于XPNPEP2在结直肠癌中的表达情况及其临床预后价值尚未见报道。在前期，我们通过GEPIA在线数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析发现，XPNPEP2在结直肠癌组织中的表达水平显著高于正常组织，因此推测XPNPEP2的表达异常可能也参与了结直肠癌的恶性进展。基于此，本研究拟利用免疫组织化学方法对113例结直肠癌组织及配对癌旁组织中XPNPEP2蛋白的表达情况进行检测，并分析其表达水平与患者临床病理特征及预后的关系，以探究其在结直肠癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择于2014年1月至2015年6月在华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院和华中科技大学同济医学院附属荆州医院接受手术治疗、并符合下述纳入与排除标准的113例结直肠癌患者为研究对象。纳入标准为：经病理学明确诊断为结直肠癌；术前未进行任何抗肿瘤治疗；接受规范性的结直肠癌根治手术；患者临床病理信息和随访资料完整。排除标准为：术前已转移、接受姑息性切除的患者；排除5年内有其他恶性肿瘤既往史者。术后病理分期采用国际抗癌协会（UICC）第7 版肿瘤分期系统。结直肠癌及对应癌旁组织样本经手术切除后迅速进行多点取材，经4%甲醛溶液固定并石蜡包埋保存备用。本研究获得华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院和附属荆州医院伦理委员会批准，知情同意书已于标本收集时签署。

1.2 免疫组化染色组织石蜡标本制作成4 μm切片，免疫组化染色按试剂盒说明书进行。主要步骤包括：石蜡切片置于恒温箱中烘烤脱蜡，再置于二甲苯中脱蜡2次，酒精梯度水化、抗原修复、内源性过氧化物酶阻断和山羊血清室温封闭后，加入兔抗人XPNPEP2 一抗（1∶200，美国Abcam公司）4℃孵育过夜；次日滴加标记有HRP的二抗（山羊抗兔二抗，武汉赛维尔生物科技有限公司），室温孵育30 min，显色剂（DAB）显色，显微镜下控制反应时间。苏木精行细胞核复染，乙醇水化及二甲苯透明，中性树胶封片，在奥林巴斯光学显微镜下进行阅片和结果判定。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 免疫组化结果评分采用双盲法由2名具有丰富经验的实验员对免疫组化结果进行阅片并评分。XPNPEP2 阳性结果为细胞出现棕黄色至深褐色。结果判定分别根据染色强度及阳性细胞百分率进行。染色强度：0 分（阴性），1 分（弱阳性，浅黄色），2 分（中等阳性，棕黄色），3 分（强阳性，褐色）；阳性细胞百分比：0 分（≤5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4 分（≥76%）。两项评分的乘积为最终的评分，总分范围0～12 分，≤6 分定义为低表达，＞6 分定义为高表达。

1.4 临床资料收集及随访通过查阅患者病历档案，收集患者临床病理信息，包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润及TNM 分期等。采用电话随访或门诊复诊等方式自手术当日起进行随访，随访截止时间为2018年12月31日，随访时间42～60个月，中位随访时间52个月。记录患者的无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）和总生存期（overall survival，OS）。RFS：确诊之日至局部复发或远处转移或最后1次随访日期；OS：确诊之日至患者死亡或最后1次随访日期。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。Kaplan-Meier 生存函数计算无复发生存率及总生存率并绘制生存曲线，组间生存差异比较采用Log-rank检验。采用单因素分析探究影响无复发生存率和总生存率的危险因素，有显著意义的风险因子（P＜0.05）纳入Cox 比例风险模型进行多因素分析，探究影响患者预后的独立危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XPNPEP2蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达水平如图1A 所示，XPNPEP2表达主要定位于细胞膜和细胞质，在结直肠癌组织和癌旁组织中均有表达，在癌组织中的表达强度高于癌旁组织。免疫组化评分显示，XPNPEP2在结直肠癌组织中的表达评分显著高于癌旁组织（t= 17.02，P＜0.001），见图1B。进一步根据肿瘤的TNM 分期分层分析显示，XPNPEP2在结直肠癌组织中的表达水平随着分期升高而升高，差异具有统计学意义（均P＜0.01），见图1C。

图1 XPNPEP2在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of XPNPEP in colorectal cancer and adjacent normal tissues

2.2 XPNPEP2蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的关系根据上述判断标准，XPNPEP2在69例结直肠癌组织中高表达，高表达率为61.06%（69/113）。进一步分析发现，结直肠癌组织中XPNPEP2 高表达与肿瘤浸润深度、脉管浸润及TNM 分期显著相关（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移均无明显统计学相关性（均P＞0.05），见表1。

2.3 XPNPEP2蛋白表达与结直肠癌患者预后的关系在113例结直肠癌患者中，XPNPEP2 高表达患者69例，无复发生存率为50.7%，总生存率40.6%；低表达患者44例，无复发生存率为72.7%，总生存率70.5%。Kaplan-Meier 生存分析显示，XPNPEP2蛋白高表达组患者的无复发生存率和总生存率均显著低于低表达组，差异具有统计学意义（χ2= 8.531，P= 0.003；χ2= 11.751，P= 0.001），见图2A和2B。

单因素分析显示，肿瘤浸润深度、淋巴结转移、脉管浸润、TNM 分期及XPNPEP2表达水平是影响结直肠癌患者无复发生存率和总生存率的危险因素（均P＜0.05），见表2；将单因素分析中差异具有统计学意义（P＜0.05）的指标纳入多因素Cox比例风险模型多因素分析表明，TNM 分期及XPNPEP2表达水平是影响患者无复发生存率（HR：2.99，95%CI：1.49～8.16，P= 0.003；HR：1.66，95%CI：1.19～2.96，P= 0.015）和总生存率（HR：5.01，95%CI：1.49～16.82，P= 0.009；HR：1.75，95%CI：1.24～3.57，P=0.023）的独立危险因素，见表3。

3 讨论

XPNPEP2蛋白作为一种广泛存在于原核生物和真核生物中的氨基酰基脯氨酸水解酶，由XPNPEP2 基因编码，主要表达于人体的肾、肝和肺的内皮细胞和上皮细胞表面[11]。在既往的研究中，主要关注了XPNPEP2在心血管疾病中的功能[13-14]，很少探讨关其在恶性肿瘤中的作用。到目前为止，仅局限于宫颈癌、前列腺癌和胃癌中，但扮演的角色却不尽相同[15-17]。在本研究中，我们通过分析113例结直肠癌组织中XPNPEP2蛋白的表达水平及其与患者临床病理学特征和预后的相关性，证实了XPNPEP2在结直肠癌组织中表达显著上调，且其高表达与肿瘤浸润深度、脉管浸润、TNM 分期及患者不良预后显著相关。进一步的单因素和多因素分析提示，XPNPEP2 高表达是影响患者无复发生存期和总生存期的独立预后因素。上述研究结果表明，XPNPEP2在结直肠癌中扮演着促癌基因的角色，这与其在胃癌和宫颈癌中的作用相似[15，17]。

表1 XPNPEP2在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系Tab.1 The relationship between XPNPEP2 expression and clinicopathological characteristics in colorectal cancer

表2 影响结直肠癌患者预后的单因素分析Tab.2 Univariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表3 影响结直肠癌患者预后的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

目前，关于XPNPEP2 影响恶性肿瘤发生发展的具体机制，研究仍较为有限。CHENG 等[15]首先报道了XPNPEP2在宫颈癌中的表达及功能，研究者通过一系列体外、体内实验结合临床样本分析，发现XPNPEP2在宫颈癌组织中表达显著上调，且其高表达与淋巴结转移和更晚的FIGO 分期有关，生存分析表明XPNPEP2 高表达患者的总生存期显著缩短。进一步的机制研究证实，XPNPEP2可通过诱导宫颈癌细胞的EMT 进程，增强其侵袭和迁移能力，进而介导宫颈癌的进展与转移。最近，LI 等[16]通过高密度多器官肿瘤组织阵列芯片分析XPNPEP2在人体肿瘤标本中的表达谱，结果显示XPNPEP2在正常前列腺组织中适度表达，而在前列腺癌中显著降低；进一步，研究者使用TCGA数据库，IHC和ELISA验证了XPNPEP2在前列腺癌患者组织和血清中的表达水平，发现XPNPEP2在前列腺癌组织中的表达水平显著低于正常前列腺组织，但在局部晚期和淋巴结转移的前列腺癌组织中的表达水平较早期前列腺癌更高，联合使用PSA和XPNPEP2可提高对患者淋巴结转移的预测准确性。王伟等[17]的研究发现，XPNPEP2蛋白在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织，其高表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、脉管浸润及TNM 分期均无明显相关性；生存分析表明XPNPEP2 高表达的胃癌患者生存率显著低于低表达者，而COX多因素分析显示XPNPEP2 不是影响胃癌患者预后的独立危险因素。上述研究结果提示，XPNPEP2在恶性肿瘤中的表达和作用可能具有癌种特异性，不同肿瘤中XPNPEP2的表达水平、临床意义及分子功能不尽相同。

本研究通过临床样本检测分析，首次证实了XPNPEP2在结直肠癌组织中表达上调，并与多种不良临床病理学特征及患者的不良预后密切相关。然而，本研究仅局限于临床样本分析，未在细胞及动物水平对XPNPEP2 介导结直肠癌发生发展的分子机制进行进一步的探索和验证；同时，本研究纳入的临床样本来源于两中心，且数量仅为113例，可能使得某些分析结果出现偏移。尽管如此，本研究的结果为进一步探究XPNPEP2在结直肠癌中的分子功能及潜在机制奠定了一定基础。在未来，我们一方面将收集更多临床样本对本研究结果进行进一步验证；同时也将开展体外及体内实验，对XPNPEP2 促进结直肠癌的潜在分子机制进行探究。

综上所述，本研究结果表明XPNPEP2在结直肠癌组织中表达显著上调，其高表达与多种不良临床病理特征及患者的不良预后密切相关，可作为评估结直肠癌患者预后的潜在生物标志物。