丹参酮Ⅱ-A磺酸钠通过调控高迁移率组蛋白1减轻内毒素导致的大鼠急性肺损伤

刘涛 刘伟欣 贺明 杨玉姣 吴珍 胡旭光

1广东药科大学（广州510006）；2 广州白云山和记黄埔中药有限公司（广州510515）；3 广东药科大学附属第二医院（广州新海医院）（广州510300）

在脓毒症发病过程中，有将近50%的患者会出现急性肺损伤的症状，该并发症是导致脓毒症患者死亡的主要原因之一[1-2]。临床上，对于脓毒症伴随急性肺损伤的治疗手段有限，因此，发展新型的治疗方法及治疗药物对该病的治疗极为重要。

高迁移率组蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种极为保守的，广泛存在于细胞内的一种类组蛋白[3]。研究[4-8]发现，在炎症情况下，被免疫细胞分泌至细胞外的HMGB1是一种晚期致死性炎症因子，会反向促进更多的炎症因子分泌，诱导机体产生严重的炎症反应。HMGB1 特异性的抗体和HMGB1 受体抑制剂的使用相继被证明可以有效缓解急性炎症反应[9]。在相应的药物治疗开发方面，中医药的是一个巨大的宝库，中药抗炎治疗将会是临床上一项重要的方法。本研究即对中药丹参的提取物丹参酮Ⅱ-A磺酸钠的抗炎效果进行了研究。

丹参酮Ⅱ-A磺酸钠有诸多的功能，如降低心肌梗死范围，减少氧自由基，提高心肌耐缺氧能力等[10-13]。然而，多数的研究都集中于丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对于心脏疾病，血液疾病的效果上，对于炎症反应的治疗却少有提及，仅有部分研究表明它对于急性肺纤维化有较好的疗效。因此，本研究从脓毒症所致急性肺损伤着手，观察丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对于急性炎症的疗效，为临床治疗急性炎症提供一种新的备选药物。

1 材料与方法

1.1 材料脂多糖（LPS）（货号：L2880），地塞米松（货号：D4902）从美国Sigma公司购得，丹参酮Ⅱ-A磺酸钠注射液（国药准字H31022558），从广东省中医院购得。

1.2 动物SD 大鼠，雄性，体质量180～220 g，南方医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（粤）2017-0021。所有动物都饲养在温度22℃和湿度55%的环境中，饮水与食物充足供应。本次动物实验符合动物伦理委员会的要求。

1.3 动物实验

1.3.1 病死率观察将大鼠随机分为正常组（Control 组），模型组（LPS 组），丹参酮Ⅱ-A磺酸钠低剂量组（LD 组），丹参酮Ⅱ-A磺酸钠高剂量组（HD组）及阳性对照组（地塞米松，Positive Control）各10只。Control 组腹腔注射生理盐水，其余各组均腹腔注射LPS（15 mg/kg），之后，LD 组和HD 组分别给予丹参酮Ⅱ-A磺酸钠腹腔注射8 mg/kg和16 mg/kg，阳性对照组给予地塞米松（1 mg/kg）腹腔注射，分别在6、12、24、48和72 h 这5个时间点观察大鼠的死亡数量，以此来推测丹参酮Ⅱ-A磺酸钠的疗效。

1.3.2 血清及肺组织提取50只SD 雄性大鼠，分组及治疗同上。药物注射24 h后，采用戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，腹主动脉采血5 mL，离心后取上清，-80℃冻存（Elisa 备用）。取大鼠右侧肺组织，切块后一半甲醛固定（病理切片备用），另一半-80℃冻存（Western Blot及qPCR 备用）

1.4 病理切片制备经甲醛固定的肺组织经常规石蜡包埋后切成3 μm的薄片，利用二甲苯及不同浓度的酒精和水进行脱蜡，采用苏木精和伊红进行染色，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，封片后采用显微镜进行拍照，通过对图片进行评分观察其病理状态的改变[14]。

1.5 酶联免疫吸附测定（Elisa）血清中HMGB1、血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度均采用Elisa 试剂盒（英杰公司，美国）进行测定。将100 μL的血清加入包被有上述蛋白抗体的微孔中，室温孵育1 h后清洗3 遍，加入辣根过氧化物酶偶联的抗体并孵育1 h，清洗后加入TMP 基质，室温孵育1 h后加入终止液，采用450 nm 波长的光测定其吸光值。

1.6 蛋白免疫印记分析（Western Blot）肺组织研磨后加入RIPA 裂解液（赛默飞，货号：89900）和蛋白酶抑制剂（赛默飞，货号：78425B）的混合液（100∶1）。12 500转离心15 min后，取上清即得肺组织的总蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行跑胶分离蛋白，转印至PVDF 膜，7%牛奶封闭后，采用anti-HMGB1（1∶1 000，货号ab79823，Abcam），Anti-TNF-α（1∶1 000，货号：ab1793，Abcam），anti-β-actin（1∶1 000，货号：ab8226，Abcam），Anti-IL-1β（1∶1 000，货号：YT5201，ImmunoWay）进行孵育，4℃过夜。回收一抗后，用偶联辣根过氧化物酶的抗IgG 抗体进行孵育1 h，采用化学发光法进行检测。

1.7 定量聚合酶链反应（qPCR）取肺组织，研磨后利用trizol 提取方法提取RNA，按照TaKaRa 逆转录试剂盒的操作说明对各组的RNA进行逆转录，条件如表1所示。然后进行Real Time PCR 反应，引物如表2所示，PCR 反应条件如表3所示。

表1 逆转录反应体系Tab.1 Reverse transcription reaction system

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

表3 Real Time PCR 反应体系Tab.3 Real time PCR reaction system

1.8 统计学方法采用SPSS 21.0进行统计学分析，图片采用Graphpad Prism 5.0进行制作。数据采用均数±标准差进行表示，组间比较采用方差分析进行比较，存活率采用Kaplan-Meier 方法进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠提高LPS 诱导的急性肺损伤大鼠的存活率动物的生存情况是判断药物是否有效的重要标准，如图1所示，使用LPS 刺激后的大鼠在72 h内有80%的病死率（P＜0.001），丹参酮Ⅱ-A磺酸钠治疗后，有效提升了大鼠的存活率，其中LD 组与阳性对照组更加接近。

图1 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠提高LPS 诱导的急性肺损伤大鼠的存活率Fig.1 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the survival rate of lps-induced acute lung injury in rats

2.2 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠改善LPS 诱导的急性肺损伤的病理损伤经LPS 刺激后，大鼠肺组织出现了典型的炎症病理反应，如肺泡间隔增厚，出血，水肿及炎性细胞浸润。而丹参酮Ⅱ-A磺酸钠组及阳性对照组的相关症状均被有效缓解（图2A）。经LPS 刺激后，LPS 组肺组织的病理学评分也显著高于Control 组，而丹参酮Ⅱ-A磺酸钠组及阳性对照组也显著低于LPS 组（图2B，表4），说明丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对急性肺损伤的有效性。

2.3 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低脓毒症大鼠血清炎性因子的分泌水平LPS 刺激导致大鼠血清中炎性因子HMGB1，TNF-α和IL-1β的水平显著增高（P＜0.05），丹参酮Ⅱ-A磺酸钠可有效降低血清中炎性因子的分泌水平，与阳性对照药物地塞米松效果相似（图3，表5）。

2.4 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低肺组织中HMGB1和NF-κB的水平LPS 刺激诱导肺组织中HMGB1及NF-κB P65的蛋白表达水平及mRNA 转录水平显著升高（图4D、4E，P＜0.05），丹参酮Ⅱ-A磺酸钠有效抑制了HMGB1和NF-κB P65的转录，并且降低了组织中的蛋白表达水平（图4A～C，P＜0.05）。

3 讨论

急性肺损伤是一种常见的脓毒症并发症，该损伤主要是由于急性的炎症反应所导致的。在临床上，虽然已经有一些治疗方案用于针对急性肺损伤，然而该病的预后仍不容乐观。鉴于此，研究者针对该病也制作出了不同的动物模型，用于深一步的研究[15-16]。本次研究使用了最常用的LPS诱导来建立脓毒症伴随急性肺损伤的模型，用于探究丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对于急性肺损伤的疗效。因地塞米松可抑制炎症细胞的集聚，并抑制炎症化学中介物的合成和释放，故本研究使用地塞米松作为阳性对照药物。研究结果显示，丹皮酚可以有效提高脓毒症伴随急性肺损伤大鼠的存活率，同时，降低因LPS 刺激所导致的肺组织充血，水肿，炎性细胞浸润以及炎性因子的分泌。这些结果都表明丹参酮Ⅱ-A磺酸钠可作为临床治疗急性肺损伤的另一种备选方案。

图2 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠改善LPS 诱导的急性肺损伤的病理损伤Fig.2 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the pathological damage of LPS induced acute lung injury

表4 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠改善LPS 诱导的急性肺损伤的病理损伤评分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

表4 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠改善LPS 诱导的急性肺损伤的病理损伤评分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

组别例数评分Control 组10 1.3±0.13 LPS 组5 5.5±0.15 LD 组7 2.5±0.11 HD 组8 0.4±0.09阳性对照组8 2.2±0.11

图3 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低毒症大鼠血清中炎性因子的分泌水平Fig.3 Tanshinone IIA sodium sulfonate reduces the level of inflammatory factors in serum of virulent rats

表5 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低毒症大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

表5 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低毒症大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

组别例数HMGB1 IL-1β TNF-α Control 组10 237±6.89 367±16.05 154±6.87 LPS 组5 1 561±117.8 1 925±92.47 834±67.64 LD 组7 398±55.19 705±64.99 315±13.21 HD 组8 498±52.55 592±51.68 350±19.61阳性对照组8 435±52.31 561±33.46 239±14.62

图4 丹参酮Ⅱ-A磺酸钠降低肺组织中HMGB1和NF-κB的水平Fig.4 Tanshinone IIA sodium sulfonate decrease the level of HMGB1 and NF-kappa B in lung tissue

HMGB1在正常情况下多集中于细胞核内，一旦受到LPS的刺激，即会转运出核并分泌至细胞外，细胞外的HMGB1 则会成为一个致死性的炎症因子。因此，血清中HMGB1的含量对于炎症严重程度是一个重要的影响[17-19]。HMGB1的提高会导致其受体RAGE 也随之升高，进而激活其下游包括NF-κB在内的炎症相关通路[20]。因此，对于急性肺损伤的患者，抑制HMGB1的过度表达及分泌或者其下游的炎症通路至关重要。目前，应用HMGB1的抗体及抑制剂可降低血清中HMGB1的含量，并提高脓毒症休克小鼠的生存率。本次研究结果表明，LPS 刺激后可显著提升大鼠肺组织中HMGB1的分泌量，而丹参酮Ⅱ-A磺酸钠可降低炎性肺损伤大鼠肺部HMGB1的分泌，这可能是其发挥抗炎功效的关键点。

NF-κB 介导的炎症反应是脓毒症反应中重要的一部分。抑制状态下的NF-κB 主要存在于细胞质内并和其抑制物IκBα 相结合。在炎症反应中，IκBα 会被降解，NF-κB 则会转运至细胞核内，促进多种炎症因子（如细胞因子，趋化因子，黏附因子）的转录[21-22]。本次研究也表明了丹参酮Ⅱ-A磺酸钠可抑制NF-κB的表达，并抑制在LPS 刺激下其下游的TNF-α和IL-1β的表达。

本次研究表明，丹参酮Ⅱ-A磺酸钠通过抑制HMGB1的表达和分泌，降低NF-κB的激活并抑制炎性因子的分泌来提高LPS 刺激的脓毒症伴急性肺损伤大鼠的存活率。低剂量和高剂量的丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对炎症反应的缓解能力并无差异，最佳用药剂量仍需进一步探讨。另外，本次研究虽证明了丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对大鼠急性肺损伤是通过抑制HMGB1和NF-κB 来实现的，但仍缺乏有力的反向验证，同时，HMGB1和NF-κB在细胞内的定位很大程度上决定了其功能，而其定位则主要受到其本身的乙酰化和磷酸化修饰的影响，这两者都是本项目下一步研究的重点方向。