灵菌红素通过促进Bim调控人乳腺癌细胞凋亡

叶惠荣， 吴丽华， 张玉娟， 高学忠， 王西跃， 曹茵

［关健词］ 人乳腺癌MCF⁃7细胞；灵菌红素；细胞增殖；细胞凋亡

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，是女性第二大恶性肿瘤，发病年龄日趋年轻化，严重威胁女性身心健康［1］。约15%～20%的乳腺癌患者会发生骨、肺和脑转移，乳腺癌骨转移的5年生存率仅为20%［2］。研究与开创各类治疗乳腺癌的药物和方法具有十分重要的意义。

灵菌红素（prodigiosin，PG）是一类天然红色素家族的总称，由多种放线菌和细菌属产生的具有多种生物学活性的次级代谢产物，PG的生物学活性主要包括免疫抑制、抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗疟疾等［3］。多项研究发现PG在治疗肿瘤方面具有重大潜力，美国癌症研究所Melvin等［4］研究发现PG浓度为2.1 μmol/L时对57中不同肿瘤细胞具有抗肿瘤活性、对正常细胞则无明显毒副作用，提示PG对肿瘤细胞作用具有靶向性。既往研究显示PG能够诱导肝癌细胞［5］、脑胶质母细胞瘤细胞［6］、口腔鳞癌细胞［7］、急性淋巴细胞白血病细胞［8］等。然而尚不清楚其对乳腺癌MCF⁃7细胞的凋亡调控作用和机制，因此本研究拟通过体外实验探讨PG调控人乳腺癌细胞增殖和凋亡中发挥的作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 人乳腺癌细胞获取

人乳腺癌细胞系MCF⁃7购于中国科学院上海生命科学研究院生命化学与细胞生物学研究所。

1.2 试剂耗材

灵菌红素Prodigiosin（CAS号 56144⁃17⁃3，Sig⁃ma公司），MEM培养基（Gibco公司），Bim抗体（#2933，CST公司），β⁃Tubulin Antibody抗体（#2146，CST公司），CCK8试剂盒（Catalog no.C0009，碧云天公司），TUNNEL试剂盒（Catalog no.12 156 792 910；Roche公司），慢病毒LV⁃sh Bim购自百恩维生物。

1.3 细胞处理

培养MCF⁃7细胞，使用不同浓度PG培养液处理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），于24、48、及72小时收集细胞，MTT检测细胞增值率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。RT⁃PCR及Western Blot检测Bim（Bcl⁃2⁃interacting mediator of cell death）表达情况。为了进一步明确灵菌红素通过Bim调控MCF⁃7细胞凋亡，构建Bim siRNA。采用实时荧光定量PCR方法检测MCF⁃7细胞中Bim表达情况以确保沉默效率；检测MCF⁃7细胞中Bim沉默后，PG对MCF⁃7细胞的凋亡诱导情况。

1.4 MTT实验

取对数生长期MCF⁃7细胞，重悬浮后调整细胞浓度为1×104个细胞/孔的密度铺于96孔板中。24小时后分别加入不同浓度的PG培养液处理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），每个浓度组平行4孔。PG处理24、48、及72 h后每孔加入MTT 100 μL，置于培养箱中4 h。弃上清、加入DMSO 100 μL，避光震荡10 min后使用酶标仪在570 nm波长检测各孔吸光度值。细胞存活率=测试组OD平均值/对照组OD平均值×100%。

1.5 TUNEL实验

消化对数生长期细胞，依据说明书将MCF⁃7细胞1×105/mL加入96孔板，分别给予不同分组刺激后，移除上清液并无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，配置TUNEL孵育液并加入MCF⁃7细胞中孵育1 h，弃去TUNEL并PBS清洗一遍，加入DAPI（1 μg/mL）避光孵育15 min，加入抗荧光淬灭液，最后荧光显微镜下观察荧光并拍照。

1.6 流式细胞（FCM）实验

依据说明书将MCF⁃7细胞以1×106/孔接种于6孔板，分别给予不同分组刺激后，移除上清液、PBS清洗、胰酶消化、血清终止，离心后重悬浮细胞，调整细胞密度为 5×105～1×106/mL。取100 μL细胞悬液至流式细胞管中，加入Annexin V⁃FITC 5 μL和10 mg/L碘化丙啶（PI）10 μL，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。增殖指数（PI）=（S+G2/M细胞数）/（G0/G1+S+G2/M细胞数）×100%；凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/细胞总数。

1.7 RNA提取和Real⁃time RT⁃PCR

收集处理好的各组细胞、PBS洗涤后提取RNA，使用逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit将RNA逆转录为cDNA。罗氏Light⁃Cycler PCR仪进行扩增，程序为95℃预变性10 min，95℃变性 5 s，60℃退火34 s，40次循环后，95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃再变性 15 s，GAP⁃DH 作为内参。引物序列为：GAPDH⁃F：5′⁃CCA GAA CAT CAT CCC TGC CTC TAC T⁃3′，GAPDH⁃R：5′⁃GGT TTT TCT AGA CGG CAG GTC AGG T⁃3′；Bim⁃F：5′⁃CTG CAG ATA TGC GCC CAG AGA T⁃3′，Bim⁃R：5′⁃CACCAGGCGGACAATGTA ACG⁃3′。

1.8 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示；组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PG对MCF⁃7细胞增殖的影响

MTT法检测PG处理后MCF⁃7细胞的生长情况，通过公式计算细胞存活率。实验结果显示PG对MCF⁃7细胞增殖具有显著抑制作用，抑制作用呈时间浓度依赖。PG对MCF⁃7细胞在不同时间点的半数抑制浓度（IC50）不尽相同，在24、48及 72 h的 IC50值分别为 11.8、6.2、3.9 μg/mL。见图1。

2.2 PG对MCF⁃7细胞周期的影响

为了进一步检测PG对MCF⁃7细胞生长增殖的影响，我们采用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果显示在PG处理下，处于S期的MCF⁃7细胞数目显著升高，作用效果呈浓度依赖性，结果提示PG能影响MCF⁃7细胞的增殖周期。PG处理后MCF⁃7细胞S期显著减少、增殖指数下降，G1期显著增加，提示PG通过抑制S期细胞DNA复制，从而抑制MCF⁃7细胞进一步分裂增殖。（图2）。

2.3 PG对MCF⁃7细胞凋亡的影响

为检测PG对MCF⁃7细胞凋亡的影响，我们采用流式细胞仪检测。结果显示PG能促进MCF⁃7细胞凋亡，并呈剂量浓度依赖性。对照组MCF⁃7细胞凋亡率约 3.6%，1、2、4 μg/mL的 PG处理MCF⁃7细胞24小时后，其早期凋亡率呈浓度梯度上升趋势，此外PG促凋亡效果呈剂量依赖性（图 3）。

2.4 PG通过促进Bim调控MCF⁃7细胞凋亡

上面研究显示PG能够促进MCF⁃7细胞凋亡，然而其具体机制不清。Bim是重要的凋亡相关蛋白，因此我们检测PG是否通过Bim从而调控凋亡。RT⁃PCR及Western blot检测结果显示PG能够促进MCF⁃7细胞内Bim mRNA及蛋白的表达，并且呈浓度、时间依赖性（图4）。

鉴于PG能够上调MCF⁃7细胞中凋亡相关蛋白Bim的表达，我们推测PG可能通过促进Bim调控MCF⁃7细胞凋亡。为了验证这一假设，我们采用特异性Bim小干扰siRNA沉默MCF⁃7细胞内Bim表达，将Bim⁃siRNA及对照siRNA分别转染MCF⁃7细胞，24小时后加入PG处理。RT⁃PCR及Western Blot结果显示Bim⁃siRNA转染后，MCF⁃7细胞内Bim RNA和蛋白表达水平显著下降。流式细胞仪检测显示Bim⁃siRNA能抑制PG对MCF⁃7细胞凋亡促进作用，MCF⁃7细胞细胞早期凋亡率明显减少，提示PG通过促进Bim调控MCF⁃7细胞凋亡（图 5/6）。

3 讨论

乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，研究显示乳腺癌发病率已跃升至女性恶性肿瘤的第二位、并且具有年轻化趋势。乳腺癌的高发病率和高死亡率已经严重威胁着女性的身心健康，其预防和治疗已成为国际急需解决的难题。

PG一类由多种细菌、放线菌产生的具有多种生物活性的次级代谢产物，其分子结构特征是含有一个三吡咯环的大共轭体系骨架。PG具有抗肿瘤活性、免疫抑制活性和抗微生物活性，因而得到广泛的研究。1977年Fullan等［9］首次证实PG在体内具有抗肿瘤活性，进一步研究发现PG对多种肿瘤细胞均具有抗肿瘤活性。鉴于PG良好的抗肿瘤活性，药物学家已经合成了多种PG衍生物，如GX15⁃070具有更好的免疫抑制活性和更低的毒性，已经进入临床Ⅰ/Ⅱ试验［10］。既往研究显示PG能通过诱导凋亡发挥抗肿瘤活性，其能对包括结肠癌、胃癌、肝癌、淋巴细胞瘤等多种肿瘤细胞发挥促凋亡作用。Yenkejeh等［5］发现PG能抑制原发性肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、效果呈剂量依赖性，并且PG是通过抑制survivin蛋白从而发挥其促凋亡活性。Cheng等［6］发现胶质母细胞瘤细胞中PG通过激活JNK通路及抑制AKT/mTOR通路，从而促进自噬性细胞死亡。Campàs等［11］发现PG能诱导慢性B细胞淋巴瘤性白血病患者的B细胞凋亡，细胞半数抑制率IC50位116±25 nM。Cheng等［7］发现口腔鳞状上皮细胞癌细胞中PG通过P62/LC3⁃I/LC3⁃II通过促进细胞自噬性细胞死亡。此外PG还通过激活P38⁃MAPK磷酸化，从而诱导Jurkat细胞凋亡［12］。PG还具有拓扑异构酶的双重活性，能诱导单链和双链DNA裂解，从到引起细胞周期阻滞，此过程伴或不伴有细胞凋亡［13］。

本文研究了PG抗乳腺癌的药效作用，及其抗癌机制做了初步探讨。MTT结果显示PG能抑制肿瘤细胞增殖、且与药物浓度和作用时间呈正相关，作用24小时的IC50值为24 μg/mL。流式细胞仪检测发现PG能通过抑制S期MCF⁃7细胞DNA复制使其停滞与G2期，从而抑制其进一步分裂增殖。随后本研究采用流式细胞仪及TUNNEL实验检测PG调控MCF⁃7细胞凋亡的作用，流式检测发现低浓度的PG在短时间内诱导MCF⁃7细胞凋亡并不明显，但随着作用时间延长以及药物浓度升高，MCF⁃7细胞凋亡率呈上升趋势，提示PG诱导MCF⁃7细胞凋亡呈时间、药物浓度依赖性。

Bim的全称是Bcl2 interaction mediator of cell death，Bim接到凋亡刺激后就会与LC8一起从复合体上解离出来游离在胞浆中，并拮抗LC8和Bcl2的功能、从而诱导细胞凋亡［14］。既往研究显示Bim具有抗肿瘤活性，表达与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及非小细胞肺癌等，Bim表达上调能引起肿瘤细胞凋亡［15］。为了研究Bim在PG诱导MCF⁃7细胞凋亡中的作用，本研究采用RT⁃PCR及Western Blot检测发现PG能诱导MCF⁃7细胞中Bim高表达，提示PG可能通过Bim发挥其促凋亡作用。进一步我们采用siRNA将MCF⁃7细胞中Bim沉默，流式细胞检测显示Bim沉默能抑制PG对MCF⁃7细胞的凋亡诱导作用。

综上所述，本研究通过干扰RNA等试验手段发现灵菌红素与MCF⁃7细胞增殖凋亡进程，并且灵菌红素能通过上调Bim，从而抑制人乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡。研究提示灵菌红素作为新型抗肿瘤药物，具有一定的应用前景，其具体作用机制仍有待进一步研究。