复合菌固体发酵构树生产蛋白饲料的试验研究

■张秀江 王品胜 丁 松 高正龙 向凌云 方玉美 胡 虹* 吕文竹

(1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省高新技术实业有限公司，河南郑州450008；3.信阳市畜牧工作站，河南信阳464000）

构树（Broussonetia papyrifera）属桑科构属多年生落叶乔木或亚乔木，在我国大部分地区广泛分布，自然条件下常见于沟谷、村旁、缓坡和丘陵以及山涧石缝中生长[1]。构树作为我国的乡土树种，因其营养丰富、蛋白质含量高、速生性强等特点，作为蛋白饲料倍受到关注[2]。构树饲料蛋白质含量高，是一种潜在的的优质植物蛋白质饲料原料，但因其复杂的蛋白质结构，在单胃动物胃肠道内不易降解，很难被消化吸收,不能充分利用。构树饲料较高的粗纤维含量对单胃动物营养物质的消化吸收也有一定的影响[3]。另外，构树叶中还含有抗营养因子单宁和木质素。单宁主要是与饲料中的其他营养成分结合，影响动物对饲料营养物质的消化吸收，造成营养成分利用不充分，降低饲料的营养价值，单宁含量过高，还影响饲料的适口性，导致动物采食量下降。木质素结构复杂，难以被畜禽消化利用，是直接导致构树饲料消化利用率低的主要原因。如何提高构树饲料中粗蛋白的含量，特别是容易被动物消化吸收的酸溶蛋白含量，降低粗纤维、木质素和单宁等抗营养因子的含量，开发出优质高效的构树蛋白饲料，增加构树饲料在动物基础日粮中的添加比例和使用效果是目前急需解决的技术问题。本试验利用复合益生菌固体发酵构树饲料，通过正交试验优化发酵技术参数，明确发酵条件对构树发酵生产蛋白饲料的影响，旨在探讨优质高效的构树蛋白饲料开发路径，为构树饲料更加广泛的应用提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

试验用菌种为复合益生菌固体粉剂，含枯草芽孢杆菌≥2.5×108个/g，嗜酸乳杆菌≥2.0×108个/g，酿酒酵母菌≥1.0×108个/g。

1.1.2 原料

构树饲料采用构树全叶试验，采于7 月中旬信阳罗山县莽张镇。叶片选择1～1.5 m 高当年生的构树，高、中、低部位随机摘取，自然条件下晒至含水量10%以下，粉碎过30 目分析筛，装袋备用。玉米粉、麸皮、稻糠为市售产品,糖蜜主要成分为蔗糖，红褐色黏稠液体，干物质含量为48.98%，水溶性糖含量为64.8%。

1.1.3 培养基

试验发酵培养基（1 kg）：构树粉700 g、玉米粉100 g、麸皮50 g、稻糠50 g、糖蜜100 g。

1.1.4 仪器

样品粉碎机（ⅩI-A），江苏金坛迅生仪器厂；凯氏定氮仪（KDN-04D），北京新诺立华仪器有限公司；电阻炉（SX2-12），武汉格莱莫检测设备有限公司；离心机（Multifuge X1R），德国Thermo 公司；电热恒温培养箱（DRP-9052型），上海森信；全波长扫描式多功能读数仪（Varioskan Flash），美国THERMO；电子天平（ME204E），上海梅特勒-托利多；立式压力蒸汽灭菌锅（SX-500），日本TOMY。

1.2 方法

1.2.1 试验方法

试验发酵培养基无需灭菌，用1 000 ml三角瓶装入发酵培养基，在恒温培养箱中进行发酵培养，以粗蛋白质的含量为考察指标，对菌种接种量、培养基装料量、培养基初始含水量、发酵温度、发酵时间进行优化。按正交试验优化的条件发酵构树饲料，比较发酵前后构树饲料营养成分含量的变化。

1.2.2 试验设计

1.2.2.1 菌种接种量的优化

将试验发酵培养基装入1 000 ml的三角瓶中，其他发酵条件一致，分别接入2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的菌种进行固体发酵，48 h 后通过测定发酵培养物中粗蛋白的含量来确定最佳的菌种接种量。

1.2.2.2 培养基装料量的优化

在1 000 ml 的三角瓶中分别装入试验发酵培养基100、200、300、400、500、600、700、800、900 g，其他发酵条件一致，进行固体发酵，48 h 后通过测定发酵培养物中粗蛋白的含量来确定最佳的培养基装料量。

1.2.2.3 培养基初始含水量的优化

将试验发酵培养基装入1 000 ml的三角瓶中，其他发酵条件一致，分别调节培养基的初始含水量为48%、51%、54%、57%、60%、63%、66%、69%、72%，发酵48 h 后通过测定发酵培养物中粗蛋白的含量来确定最佳的培养基初始含水量。

1.2.2.4 发酵温度的优化

将试验发酵培养基装入1 000 ml的三角瓶中，其他发酵条件一致，分别在温度为24、26、28、30、32、34、36、38、40 ℃进行固体发酵，48 h后通过测定发酵培养物中粗蛋白的含量来确定最佳的发酵温度。

1.2.2.5 发酵时间的优化

将试验发酵培养基装入1 000 ml的三角瓶中，其他发酵条件一致，在发酵过程中在12、18、24、30、36、42、48、54、60 h分别测定发酵培养物中粗蛋白的含量来确定最佳的发酵时间。

1.2.2.6 正交试验

以单因素发酵条件优化结果为基础，设计4因素3 水平的正交试验，确定构树发酵生产蛋白饲料最佳的工艺参数。

1.2.2.7 构树发酵生产蛋白饲料的效果

将试验发酵培养基装入1 000 ml的三角瓶中，按正交试验确定的构树发酵生产蛋白饲料最佳工艺参数发酵构树饲料，测定发酵前后构树饲料粗蛋白、酸溶蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素和单宁的含量，比较发酵前后构树饲料成分含量的变化。

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1.2.3 测定方法

1.2.3.1 构树饲料成分的测定

饲料中的粗蛋白、粗脂肪和单宁的含量分别按GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 27985—2011的方法进行。中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、酸性洗涤木质素（ADL）参照Van Soest 等[4]方法进行测定。

1.2.3.2 酸溶蛋白质含量的测定

在酸性条件下高分子蛋白质易被沉淀，可被水解的较低分子量的蛋白质即为酸溶蛋白质。酸溶蛋白质主要包括肽和游离氨基酸。测定方法：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将样品中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中短链的肽和游离氨基酸用酸溶解出来，经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量[5]。

1.3 数据处理

试验数据采用dps 统计软件进行单因素的方差分析。

2 结果

2.1 菌种接种量对构树发酵生产蛋白饲料的影响

按不同接种量分别接入试验发酵培养基，发酵培养物中粗蛋白含量的结果如图1。枯草芽孢杆菌为好氧菌，酿酒酵母为兼性厌氧菌，嗜酸乳杆菌为厌氧菌。发酵前期枯草芽孢杆菌和酿酒酵母利用培养基中的氧气快速生长，当氧气耗尽嗜酸乳杆菌开始生长，产生大量的乳酸使发酵培养基的pH 值下降，限制枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的生长繁殖。随着菌种接种量的加大，发酵反应起步更快，单位时间内发酵反应进行更充分，发酵培养物粗蛋白含量不断增高。但菌种接种量达到一定比例后，由于大量微生物的快速生长繁殖，过度消耗构树发酵饲料中的营养成分，导致发酵培养物粗蛋白含量降低。由图1 可以看出，接种量为8%时，构树发酵饲料粗蛋白含量最高。因此确定正交试验的接种量为7%、8%、9%。

图1 菌种接种量对构树发酵生产蛋白饲料的影响

2.2 装料量对构树发酵生产蛋白饲料的影响

图2 装料量对构树发酵生产蛋白饲料的影响

2.3 培养基初始含水量对构树发酵生产蛋白饲料的影响（见图3）

图3 培养基初始含水量对构树发酵生产蛋白饲料的影响

构树试验发酵培养基的初始含水量，直接影响发酵培养物中粗蛋白的含量。含水量过低，降低了发酵培养基的膨胀度，抑制菌体生长。含水量过高，培养基的透气性变差，抑制枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的生长，影响发酵效果。图3 表明，构树发酵培养基的初始含水量为57%时，发酵培养物中粗蛋白含量最高。因此确定正交试验的培养基初始含水量为54%、57%、60%。

2.4 发酵温度对构树发酵生产蛋白饲料的影响（见图4）

从图4 可见，随着发酵温度的提升，构树发酵培养物中粗蛋白的含量逐渐提高，但当温度超过34 ℃以后，构树发酵培养物中粗蛋白含量有逐渐降低的趋势。因此可以确定34 ℃是构树发酵生产蛋白饲料的最适温度。正交试验发酵培养温度设为32、34、36 ℃。

图4 温度对构树发酵生产蛋白饲料的影响

2.5 发酵时间对构树发酵生产蛋白饲料的影响（见图5）

由图5 可以看出，随着发酵时间的增加，发酵培养基中粗蛋白的含量在开始的12 h内提高速度缓慢，12～36 h 迅速提高，36～48 h 提高速度趋于平缓，发酵到48 h，发酵培养基中粗蛋白的含量最高达23.9%。随着时间的继续延长，发酵培养基中粗蛋白的含量逐渐下降，为了缩短发酵周期，减少被杂菌感染的机会，降低发酵成本，发酵最佳时间为48 h。

图5 发酵时间对构树发酵蛋白饲料的影响

2.6 正交试验优化复合菌发酵构树生产蛋白饲料的工艺参数

本试验设计L9(34)正交试验，以构树发酵培养物中粗蛋白为考察指标，确定接种量、培养基装料量、培养基初始含水量和发酵温度对构树发酵生产蛋白饲料的影响，因素和水平、正交试验结果见表1～表2。

表1 正交试验的因素和水平

表2 正交试验结果

由表2可知，从R值来看，以粗蛋白为考察指标，构树发酵生产蛋白饲料的影响程度顺序为A＞C＞D＞B，即接种量＞培养基初始含水量＞温度＞培养基装料量，其中接种量影响显著。最优组合为A3C2D2B2，即最优发酵条件参数：接种量9%、培养基初始含水量57%、温度34 ℃、培养基装料量400 g。

2.7 构树发酵生产蛋白饲料的效果

构树发酵试验培养基按正交试验优化的发酵条件进行培养，测定发酵前后构树饲料成分含量的变化，结果见表3。表3 表明构树饲料发酵前后粗蛋白和酸溶蛋白的含量分别提高35.23%和70.88%，差异显著(P＜0.05)，酸溶蛋白占粗蛋白的比由40.27%提高到50.89%；粗脂肪含量变化不明显(P＞0.05)；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、单宁的含量分别降低25.00%、34.59%、18.53%、85.95%，差异显著(P＜0.05)。

表3 构树发酵蛋白饲料的效果

3 讨论

试验结果表明，本试验选用的含3种益生菌的复合菌剂发酵构树饲料，在发酵过程中3种益生菌彼此之间有一定的协同作用，作用与功能互补。发酵前期枯草芽孢杆菌和酿酒酵母生长繁殖，消耗氧气，随着构树发酵培养基中氧气的减少，嗜酸乳杆菌开始生长繁殖，产生乳酸及一些抑制杂菌感染的物质，发酵培养物的pH 值逐渐降低，且有效地控制其他杂菌的感染。发酵过程中还会不断产生积累一些醇、醛等芳香类物质和多种生物酶类及未知生长因子，这些生物发酵产物可以显著提高构树发酵饲料的适口性，增加构树饲料的消化吸收率，这与国内多数学者的研究结果一致[6-8]。

构树饲料蛋白质结构复杂，畜禽消化吸收困难，丰富的蛋白质资源没有被充分的开发利用，造成严重的资源浪费。用发酵技术处理构树饲料不仅能降解构树饲料大分子复杂结构的蛋白质，还能使粗蛋白和游离氨基酸的含量增加，提高动物对构树饲料营养物质的消化吸收和构树饲料蛋白质的利用价值[9]。何国英[10]研究表明，通过酶工程技术和生物工程技术对构树饲料进行微生物发酵处理，能够将构树饲料中结构复杂的大分子蛋白质降解，提高粗蛋白和游离氨基酸的含量。杨青春等[11]用米酒曲发酵构树叶片后，生长猪对构树叶饲料粗蛋白、粗纤维、干物质、无氮浸出物、磷以及总能的表观消化率均有不同程度的提高。李海新[12]利用生物工程技术、酶工程技术对构树叶进行发酵处理，使构树蛋白质消化的吸收率达80%以上。熊罗英等[13]利用枯草芽孢杆菌发酵构树叶,与未发酵相比，肉仔鸡对发酵构树叶的粗蛋白和粗纤维的消化率显著提高。熊罗英等[14]报道，采用外源酶发酵构树饲料具有提高游离氨基酸含量，降解粗纤维的效果，可以提高三黄鸡对构树粗蛋白、粗纤维等营养物质的消化。李海新[12]用米酒曲发酵构树叶粗蛋白含量增加5.29%。本试验发酵后构树饲料中的粗蛋白含量提高了35.23%，与前述学者研究的结果一致。饲料中酸溶蛋白主要包括肽和游离氨基酸，最容易被畜禽消化吸收利用，酸溶蛋白含量的高低可作为评价饲料中粗蛋白质量好坏的主要指标，酸溶蛋白在构树饲料发酵蛋白方面的研究少见文献报道。本试验构树饲料经发酵酸溶蛋白的含量提高了70.88%，表明复合菌发酵构树饲料不仅提高了粗蛋白的含量，还能够大幅度的提高畜禽对构树饲料蛋白的消化吸收率。

构树饲料中单宁、粗纤维等抗营养因子影响构树饲料的适口性和畜禽对营养物质的消化和利用。构树的适口性差在于构树本身的粗纤维和单宁含量高[15]。发酵和青贮技术对木质素和植物纤维具有软化作用，对提高饲料的适口性有很大的帮助[11]。熊罗英等[16]通过发酵处理，构树叶的单宁含量显著下降，从发酵前的1.69%降到发酵后的0.061%，下降了96.39%。本试验发酵后构树饲料单宁含量降低了85.95%，与前述学者研究的研究结果一致。构树叶粗纤维含量高，粗纤维主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，单胃动物难以消化纤维素、半纤维素，木质素对全部畜禽均不能消化利用，通过微生物发酵可以降解粗纤维，降低其含量，提高饲料消化利用率。本试验对构树饲料中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的含量进行试验研究，更能准确反映构树饲料中纤维素、半纤维素，木质素的含量。张益民等[17]用啤酒酵母和米曲霉发酵构树叶，粗纤维含量降低15.3%。李海新[12]发酵处理构树叶粗纤维降低21.76%。熊罗英[18]采用筛选的菌株发酵构树叶，粗纤维含量降低11.68%～14.96%。本试验构树饲料发酵后中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的含量分别降低25.00%、34.59%、18.53%，与前述学者研究一致。

4 结论

采用含枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的复合菌固体发酵构树饲料，以粗蛋白含量为考察指标，通过L9(34)正交试验确定构树饲料发酵最佳工艺参数为接种量9%、培养基初始含水量57%、温度34 ℃、培养基装料量400 g、发酵时间48 h。构树饲料经发酵粗蛋白和酸溶蛋白的含量分别提高35.23%和70.88%，酸溶蛋白占粗蛋白的比由40.27%提高到50.89%；粗脂肪含量变化不明显；中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素、单宁的含量分别降低25.00%、34.59%、18.53%、85.95%。