循环肿瘤细胞与胃癌病理分期相关性的初探

严晓伟，刘 坤，胡皆乐，姜松耀，项 明

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院普外科，上海 201801；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院外科，上海 200025）

胃癌在全世界范围内最常见的恶性肿瘤中列第5位。在我国，胃癌在癌症死亡率列第3位[1]，并呈年轻化趋势。目前对胃癌采用以手术为主的综合治疗模式，其中单纯手术治疗的胃癌病人总体生存率仅为20%～40%。根治性手术切除是现今唯一可治愈胃癌的方法[2]。准确评估病人分期及肿瘤状态，监测治疗过程并及时调整治疗方案，是提高胃癌病人总体生存率的一个途径。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）的检测是当下受关注较多的非侵入性液体活检方法,可用来预测预后、评估分期、监测疗效[3]，具有一定的临床意义。

资料与方法

研究上海交通大学医学院附属瑞金医院北院2016年1月至2017年12月所有进展期胃癌根治性手术的病人。病人同时进行CTC检查。并由同一组手术医师完成手术，同一组病理科医师完成病理学检查。不包括如下：①术前行新辅助治疗后行根治手术；②术后因并发症发生再次手术的病人；③术后病理检查结果为非腺癌的其他肿瘤类型。

一、研究方法

（一）CTC 检测

病人行术前CTC检测。方法及试剂为广州益善公司提供。采用纳米技术结合多重RNA原位分析技术检测，其CTC截留率＞80%，特异度＞90%。通过纳米过滤截留CTC，行细胞分离，然后行多重RNA原位分析、10个荧光通道显影，对各亚型进行分型。CTC检测包括CTC分离和分型鉴定两个部分。在CTC分离部分，抽取5 mL外周血后，首先使用红细胞裂解液裂解外周血中的红细胞，然后使用8 μm 直径的过滤膜（Millipore,Billerica,MA,USA）截留CTC。原位杂交前，先使用蛋白酶（Qiagen，Hilden,Germany）处理过滤膜上富集的CTC，然后在42℃行原位杂交2 h。使用RNA探针捕获上皮型标志物 EpCAM、CK8、CK18、CK19，间质型标志物Twist、Vimenti以及白细胞标志物CD45。然后使用洗脱液（Sigma,St Louis,USA）对无探针标记的细胞洗脱3次。使用30%马血清（Sigma,St Louis,USA）、1.5%十二烷基硫酸钠（Sigma,St Louis,USA）和3 mM Tris-HCl溶液（pH 8.0）（Sigma,St Louis,USA）在 42 ℃对标本进行保温扩增20 min。待过滤膜冷却后，重新使用洗脱液洗脱3次，之后再次进行保温扩增。预先标记针对上皮型标志物EpCAM、CK8、CK18、CK19的荧光染料Alexa Fluor594，针对间质型标志物 Twist、Vimenti的荧光染料 Alexa Fluor488和针对白细胞标志物CD45的荧光染料Alexa Fluor647，将3种荧光标记的探针加入过滤膜中，继续在42℃保温20 min。再次使用洗脱液洗脱后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma,St Louis,USA）将过滤膜上的CTC进行荧光染色5 min，然后使用荧光显微镜进行分析 （Olympus BX53,Tokyo,Japan）（见图 1）。

（二）病理检查

完成病理检查，病理报告包括肿瘤的病理类型、分化程度、神经及脉管累及情况、肿瘤浸润深度，以及淋巴结转移、远处转移的情况。

（三）CTC检测与病理分期

分析CTC检测结果与病理分期[T（肿瘤浸润深度）、N（淋巴结转移）、M（远处转移）]的关系。

（四）随访

术后2年内，每3个月检查血常规、肝肾功能和 CEA、CA 199、CA125；每 6个月作胸、腹部 CT及胃镜检查，电话和门诊结合随访。随访终点为肿瘤复发转移或失访。

二、统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行处理和分析。计数资料采用百分比，计量资料采用均数和95%可信区间。采用Spearman′s rho相关性分析。

结 果

一、一般资料

收集我院符合标准病例共30例，男18例，女12 例，平均年龄（60.4±8.1）岁。

二、CTC结果与病理TNM分期

30例病例均完成术前CTC检测及术后病理检查。包括CTC总数及其亚型（间质型、上皮型和混合型）检测。CTC阳性病例共25例，整体阳性率为83.3%。上皮型和混合型CTC阳性病例所占比例较低，分别为 20%（6/30）和 30%（9/30）。更具侵袭力的间质型CTC整体阳性率较高，为56.6%（17/30），其中Ⅰ期病例中1例兼具两型,Ⅱ期病例中2例兼具两型，1例兼具三型，Ⅲ期病例中2例兼具两型。术后病理 TNM分期显示Ⅰ期 3例 （2例 T1N0、1例T2N0）、Ⅱ期 7 例（2 例 T1、4 例 T2、1 例 T3，1 例 N0、6 例N1），Ⅲ期 20 例（3 例 T2、15 例 T3、2 例 T4，8 例 N1、8 例N2、4例 N3）。结果发现，病理分期越晚，CTC 的阳性率及间质型CTC阳性率越高（见表1）。

Spearman′s rho相关性分析发现，CTC总数与T分期无相关性（P=0.559），但与淋巴结阳性率有相关性（P=0.038）（见图 2）；间质型 CTC 数量与 N 分期和TNM分期有相关性（P=0.040、0.042）。结果表明，CTC数量，特别是间质型CTC数量与淋巴结阳性率呈正相关（见表2）。因混合型为上皮型和间质型复合形成，但各自所占比例不一，如间质型占优的混合型倾向于间质型，反之上皮型占优的混合型倾向于上皮型，所以没有可比性，本研究不作比较。

图1 免疫荧光显微镜下通过纳米技术和多重mRNA原位分析技术得到的图像

图2 CTC总数与淋巴结阳性率的关系

讨 论

CTC是指由实体恶性肿瘤原发灶或转移灶释放入血液循环系统的细胞，是恶性肿瘤复发及转移的重要途径[4]。有研究表明，进展期胃癌病人术前CTC检测及亚型分类与肿瘤分期有显著相关性[5]。Okabe等[6]研究指出CTC在胃癌转移病人中更常见，根治术前进行CTC检测可更好地评估病人分期。Huang等[7]对26个研究进行荟萃分析指出，Ⅲ～Ⅳ期胃癌病人与Ⅰ～Ⅱ期相比，CTC阳性率差异有显著性意义。以上研究提示，术前CTC检测可更早发现可能存在的微转移，是对TNM中Nx和Mx更精细分期的补充，更精确地评估分期。因此，检测外周血中的CTC具有重要临床意义。本研究发现，CTC总数与T分期和TNM分期无相关性，但与淋巴结阳性率有相关性（P＜0.05）。这可能与CTC进行血液淋巴循环，更易在外周血中检测到有关。因此，CTC总数与淋巴结阳性率相关，N分期与淋巴结阳性个数有关。当淋巴结阳性数＞6枚时都为N3。但N3中淋巴结阳性率并不相同，有些是7枚淋巴结转移，而有些淋巴结转移数量远远＞7枚。显然淋巴结阳性率与CTC数量更密切相关，这与本研究的结果相符（P=0.038）。同时N分期只是TNM病理分期的一个因素，因此本研究认为CTC总数与TNM分期无关。当然本研究样本量较少，还需更大样本量的研究进一步证实。

CTC存在不同的亚型，主要有上皮型、间质型、混合型等。目前认为，细胞上皮间质转换（epithelialmesenchymal transition,EMT）、肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）以及血管生成相关因子等在CTC中发挥重要作用[8]。为了长期存在于血液循环并保持高度侵袭转移能力，CTC具有CSC特性，而通过EMT转换使CTC具有侵袭转移的能力，这是肿瘤远处转移及复发的重要机制。因此，对CTC亚型的检测，能更精准地对进展期胃癌病人进行临床评估。本研究显示CTC数量与病理TNM分期的相关分析未显示存在相关性，但间质型CTC的数量与淋巴结转移数量、N分期及TNM分期都具有相关性（P＜0.05）。这也符合间质型CTC更具有转移性和侵袭性的特征。

CTC数量特别是间质型CTC的数量与胃癌的N分期存在相关性，对预测胃癌分期和临床预后是很好的补充，具有一定的应用价值。

表1 各TNM分期的CTC阳性率

表2 Spearman’s rho相关性分析