LRG1 在非酒精性脂肪性肝病小鼠及细胞模型中的表达*

王轶凡，卞兆连

（南通市第三人民医院肝病研究所，江苏226006）

伴随肥胖、糖尿病和代谢综合征在全球患病率的不断增加,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)目前成为慢性肝脏疾病的主要发病原因之一[1]。据统计,美国约1/3 成年人,意大利1/5～1/4 成年人患有NAFLD,在低风险人群中NAFLD 患病率也逐渐上升,在中国患病率约15%,日本患病率约14%[2]。NAFLD 主要通过肝酶升高进行初步诊断,需排除病毒感染和其它肝病[3],随后通过CT 和活检确诊。大多数NAFLD 患者长期无症状,约20%患者会发展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),进一步可导致肝硬化、门静脉高压症和原发性肝癌[1,4]。目前对NAFLD发病机制和发展为NASH 的过程未完全阐明,并无有效的治疗方法[5]。目前临床判断NAFLD 是否向NASH 或肝纤维化发展主要通过B 超、CT 和肝脏穿刺病理学等检查。由于病理学检查为创伤性检查,并存在一定的取样误差,国内很难广泛开展。近年来学者们致力于寻找有效的无创诊断NAFLD 发展进程的方法,但直至目前包括血浆CK-18、FGF-21 以及循环microRNA 检测结果的特异性和敏感性仍不理想[6-8]。LRG1(leucine rich alpha-2-glycoprotein1)蛋白是富亮氨酸重复序列(leucine rich repeat,LRR)蛋白家族的成员[9],本研究通过分析NAFLD 小鼠模型和细胞模型中LRG1 表达水平的变化,探讨LRG1 作为潜在特异性标记物的临床意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与饲料 高糖DMEM 培养基、胎牛血清、油酸、棕榈酸(美国GIBCO 公司),PCR 引物(上海生物工程有限公司),Trizol(美国Invitrogen),反转录试剂盒、SYBR Green PCR(日本Takara)。饲料：高脂饲料(脂肪含量＞50%)、正常饲料(脂肪含量13%)以及蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料(美国ResearchDiets公司)。

1.2 实验动物 SPF 级C57BL/6 雄性小鼠及ob/ob自发NAFLD 雄性小鼠(美国杰克森实验室)。实验动物饲养于南通大学实验动物中心,7：00～19：00 置于光照,19：00～7：00 黑暗环境中饲养,自由进食和饮水。本研究获得我院实验动物伦理委员会审核批准。

1.2.1 高脂饮食诱导小鼠NAFLD 模型建立：高脂饮食诱导小鼠NAFLD 模型是目前最理想的代谢综合征动物模型[10]。选用8 周龄C57BL/6 雄性小鼠,随机分为实验组和对照组,每组10 只,分别给予高脂饮食或正常食物8 周后,取肝脏组织提取RNA。

1.2.2 ob/ob 小鼠自发NAFLD 模型建立：ob/ob 小鼠存在ob 基因自发突变,导致瘦素合成障碍,是国外最常用的NAFLD 动物模型[11]。选用16 周龄C57BL/6 背景ob/ob 雄性小鼠10 只为自发NAFLD 模型,以C57BL/6 雄性小鼠10 只做对照,取小鼠肝脏组织提取RNA。

1.2.3 MCD 饮食诱导小鼠NASH 模型建立：蛋氨酸和胆碱对肝细胞脂肪酸β 氧化和极低密度脂蛋白的生成及分泌有着重要的作用。C57BL/6 小鼠经MCD饲料喂养1 周后,肝脏出现明显的细胞凋亡,2 周后发生明显的NASH[12]。本实验选用12 周龄C57BL/6雄性小鼠,分为实验组和对照组,每组10 只,分别给予MCD 饮食或正常食物4 周,取肝脏组织提取RNA。

1.3 HepG2 细胞脂肪变性模型建立 棕榈酸、油酸按摩尔质量比2∶1,以二甲亚砜(DMSO)稀释配置成终浓度为0.5 mmol 混合物,经0.22 μm 滤器过滤后置于-20℃备用。以含10%胎牛血清高糖DMEM 培养基培养HepG2 细胞,置于37℃、5%CO2培养箱。将18 μL 棕榈酸、油酸混合物与1 mL 10%牛血清白蛋白(BSA)混合,于37 ℃温浴1 h,再与18 mL 10%DMEM 充分混合,温浴1 h 后,替换六孔板中原本的培养基,刺激细胞12、24 h 后,提取细胞RNA。以未经棕榈酸-油酸处理的HepG2 细胞为对照。

1.4 实时定量PCR 检测LRG1 表达 用PBS 清洗六孔板中细胞,提取细胞总RNA,用逆转录试剂盒反转录为cDNA,采用实时定量PCR 检测LRG1 的mRNA 表达。引物序列：LRG1,F：5’-GTCCTGGAGGTCTCGTGGCTAC-3’,R：5’-AGGAGGTCAGGTGGCAAGGTC-3’;β-actin,F：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG -3’,R：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3’。

1.5 统计学处理 应用Graph Pad Prism 7 统计学软件分析,两组间差异性比较采用t检验。

2 结 果

2.1 三种模型小鼠肝脏组织中LRG1 表达 RTPCR 检测结果显示,与对照小鼠比较,高脂饮食诱导的 小 鼠NAFLD 模 型(P＜0.05)、ob/ob 小 鼠 自 发NAFLD 模型(P＜0.01) 以及MCD 饮食诱导小鼠NASH 模型(P＜0.01)肝脏组织中LRG1 表达水平显著降低,差异均有统计学意义(图1)。

图1 三种小鼠模型肝脏组织中LRG1 的表达

2.2 脂肪变性HepG2 细胞模型中LRG1 表达 RTPCR 检测结果显示,与对照细胞比较,HepG2 细胞经棕榈酸、油酸刺激12、24 h 后,LRG1 表达下降,差异均有统计学意义(P＜0.01,图2)。

图2 棕榈酸、油酸诱导的HepG2 细胞中LRG1 表达水平

3 讨 论

多项研究阐述了转化生长因子TGF-β1 在NAFLD/NASH 形成和发展中的作用,NAFLD 患者血浆中TGF-β1 上升水平对脂肪肝发展为肝纤维化的筛查呈高度敏感性和特异性[13]。Dixon 等[14]证实,血管紧张素和TGF-β1 过高表达的基因多态性NAFLD 肥胖患者,易发展为晚期肝纤维化。在动物模型中肝脏TGF-β1 表达上调会导致严重的肝纤维化[15]。相反,在多种动物模型中用不同方法抑制TGFβ1 的合成或下游信号通路,均可抑制肝细胞脂肪病变和肝纤维化[16]。值得注意的是,TGF-β 通常作为肿瘤抑制基因,但在多种癌症中其功能发生转变,成为多种致癌基因活化的启动子[17]。TGF-β1 激活信号通路与氧化应激相关,而氧化应激已在一系列临床和模型实验中被证明与肝脏疾病发展相关[18]。此外,在HK-2 细胞中也发现TGF-β1 诱导上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是通过竞争性激活PPAR-γ,一种诱导脂肪细胞分化和脂质积累的重要因子[19]。因此,血浆TGF-β1 是否可以作为新型的NAFLD/NASH 检测的无创手段,需要进一步研究。

研究表明,异常表达的LRG1 通过调控TGF-β1信号发挥其促进异常血管生成的作用。LRG1 直接与TGF-β 辅助受体Endoglin 结合,促进TGF-β1 作为配体和受体TGFβRⅡ结合后,选择性激活偶联激酶ALK1 磷酸化底物Smads 蛋白,促进Smad1、5、8蛋白进入核内,调节下游靶基因的转录,调节血管生成的信号转导通路激活。同时,研究也发现伴随着LRG1 的升高,不依赖Endoglin 辅助受体的TGFβRⅡ-ALK5-Smad2、3 这一信号通路受到抑制[9]。另有研究表明,当LRG1 下降时,TGF-β1 会结合TGFβRⅡ,通过特异性激活ALK5 磷酸化底物Smad 2、3,调节基因转录,促进细胞凋亡、脂质积累病变和纤维化标记物α-SMA 的生成[20],此时TGF-β1-ALK1-Smad 1、5 信号通路受到抑制。在体内和体外神经胶质瘤模型中,通过shRNA 降低LRG1 的表达,凋亡标记物如激活的caspase-3 和Bax 显著升高,凋亡抑制蛋白Bcl-2 下降[20]。

本研究结果发现,在高脂食物喂养、MCD 饲料喂养和ob 小鼠三种诱导NAFLD 模型中,肝脏LRG1mRNA 水平均显著下降;在棕榈酸-油酸诱导的细胞模型中,LRG1mRNA 水平也出现显著降低,提示LRG1 参与NAFLD 的发生发展。今后应进一步研究LRG1 在NAFLD 不同阶段中的生物学作用及其与病程进展的相关性,可能为NAFLD 的临床诊断及防治提供新的有效手段。

综上所述,目前NAFLD/NASH 的无创诊断存在困难,近年来血液标志物诊断NASH 存在一定的局限性,检测外周血LRG1 水平或许可以为NASH 诊断提供合适的方法。