不同品牌洗发水对蚕豆根尖细胞遗传毒性探究

2020-03-11

福建质量管理 2020年5期

(1.贺州市平桂区环境监测站广西贺州 542899) (2.湖南博咨环境技术咨询服务有限公司湖南长沙 410205)

一、前言

中国是世界上洗发水产量和销量最大的国家，洗发水主要是以表面活性剂为主体复配而成的、具有清洁人的头发和头皮、并保持其美观作用的产品，是广大群众日常生活使用量很大的日化产品。洗发水的组分包括表面活性剂、稳定剂、功能性添加剂，防腐剂和香精等[1]，轻工行业标准“QB/T1974-2004洗发液”[2]定义洗发水的有效物为总固体减去无机盐和氯化物的量，其多少决定了产品的清洁效果。洗发水主要有效物一般是阴离子表面活性剂，合适的表面活性剂能达到泡沫丰富、低刺激、洗净度高但脱脂力弱的效果。

微核(micronucleus,简称MCN)是染色体畸变类型之一，往往是细胞经辐射或化学药物作用，由有丝分裂后期散失着丝粒的染色体片断产生的[3]，其染色体与细胞核相似，比主核小，故称微核。

微核测定技术是一种遗传毒理方面的短期致突变试验方法，可用于化合物致突变性检测、环境污染监测、新药试验及癌症前期诊断等方面。微核试验(micronucleus Test)方法具有敏感度高、快速、经济、不需要精尖设备和深湛技术的优点[4]。近年来，随着分子生物学技术的发展，微核试验已发展成为可检测染色体断裂、染色体丢失、染色体不分离、细胞分裂延迟和凋亡等多个终点的细胞分子毒理学检测方法.

蚕豆(Vicia faba)是经典的遗传学研究材料[5],蚕豆染色体大，数量少(2n=12)，根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微镜观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验.

本实验选用四种品牌的洗发水，根据人们的日常用量，分别取五个不同浓度，进行蚕豆根尖的染毒实验，探究不同品牌洗发水在不同浓度时对蚕豆根尖细胞微核率的影响，探究洗发水对植物根尖细胞的遗传毒性。

二、实验

(一)实验材料

潘婷、海飞丝、飘柔、欧莱雅四种不同品牌的洗发水；青皮松滋蚕豆；

(二)实验试剂

①1mol/L HCl

②45%醋酸

③70%乙醇。

④卡诺氏液：无水乙醇(或95%乙醇)3份加冰醋酸1份配成,固定根尖时随用随配。

⑤夫氏(Schiff)试剂：称1 g碱性品红缓慢的加入到煮沸的250 mL蒸馏水中煮沸到200 mL。待其冷却到50-55℃时加入20 mL 1 mol·L-1的 HCl，过滤于深棕色试剂瓶中，待滤液瓶冷至25℃时再加1 g偏重亚硫酸钾(K2S2O5)充分振荡使其溶解。塞紧瓶口，用黑纸包好，置于4℃的冰箱中，24小时后检查如透明无色即可使用。此染色液在可保存6个月左右，若出现沉淀就不能再用。

⑥SO2洗涤液：

贮存液：(1)10% Na2S2O5溶液

(2)1 mol·L-1HCl

使用液：现用现配，取上述10% Na2S2O5(或10% K2S2O5)溶液5mL，加1mol/L HCl 5mL，再加蒸馏水100mL配成。

(三)实验步骤

1.浸种

选取大小一致颗青皮松滋蚕豆放入盛有25℃蒸馏水的烧杯中，液面略高于蚕豆种子，置25℃的恒温箱内，浸泡26-30h，期间每隔6-8h换一次水，换用的蒸馏水预先置25℃恒温箱中预热。

2.催芽

将棉纱布折叠3-4层平铺在培养皿内，加入过量25℃蒸馏水使之完全浸湿并有适量浸出，将蚕豆放入培养皿，使出芽口浸入水中，再盖上滤纸放入恒温箱中，在25℃下催芽，并适时观察补充水分，确保培养环境湿润，催芽时间约20h。

当初生根露出2-3ml时，选取发芽状况良好的63颗种子继续放入培养皿中催芽，使大部分的初生根长至2-3ml。

3.被检测液处理根尖

将配制好的四种品牌的五种不同浓度的洗发水溶液分别装入洗净的青霉素瓶中，每种浓度做两个样，每种品牌洗发水溶液装15瓶，将催好芽的蚕豆单个放在青霉素瓶口，并使蚕豆芽根部浸入溶液中，用同样方法在三个青霉素瓶中放入蒸馏水，处理蚕豆作为空白对照组。将青霉素瓶放入25℃恒温箱中染毒处理6h。

4.根尖细胞恢复处理

(1)将处理后的种子，用或蒸馏水浸泡3次，每次2—3h。

(2)种子再放在盛有蒸馏水的青霉素瓶上，使根浸入水面下，放入25℃恒温箱中使根尖细胞恢复22-24h。

5.固定根尖细胞

(1)将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根放入青霉素空瓶中，加卡诺氏固定液固定24h。

(2)将固定后的幼根，换入盛有70%乙醇的青霉素中，置 4℃的冰箱内保存备用。

6.孚尔根(Feulgen)染色

(1)定好的根尖在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗两次，每次5min。

(2)吸净蒸馏水，再加入1mol/L HCl将幼根泡住，连瓶放入60℃恒温水浴锅中水解幼根10-20min，至幼根软化。

(3)用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。

(4)在遮光条件下加席夫(Schiff)试剂，染色1h，每瓶用量以掩住幼根液面高出2mm为宜。

(5)除去染色，用SO2洗液浸洗幼根2次，每次5min。

(6)用蒸馏水浸洗1次，5min。

(7)将幼根放入新换的蒸馏水中，置4℃的冰箱内保存，供随时制片使用。

7.制片

(1)幼根放在擦净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右的根尖。

(2)滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎。

(3)加盖一清洁的盖玻片，注意不要有气泡。

(4)再在盖玻片上加一小块滤纸，用竹签轻轻敲打压片。

8.镜检及微核识别标准

将制片先置显微镜低倍镜下，找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相对较多的部位，再转到高倍镜(物镜40×)下进行观察。

(1)凡是主核大小的1/3—1/20，并与主核分离的小核。

(2)小核着色与主核相当或稍浅。

(3)核形态可以是圆形、椭圆形、不规则形。

每一种处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数。

9.数据的计算

将观察得到的有关微核数据，根据如下步骤进行统计处理：

(1)微核千分率(MCN‰)的计算：

参考标准:MCN‰在10‰以下为基本无污染；

MCN‰在10‰—18‰区间为轻污染；

MCN‰在18‰—30‰区间为中污染；

MCN‰在30‰以上为重污染。

三、实验结果及分析

利用显微镜观察到蚕豆根尖细胞情况，图1是部分观察到微核的蚕豆根尖细胞图例，箭头所标记即为微核：

图1 图2

图3 图4

(一)染毒6小时微核千分率与显著性分析

对照组镜检时得出的蚕豆根尖微核数据如下：

序号细胞数微核数微核千分率(‰)平均微核率(‰)x±s1#2#3#1000100010006556555.33±0.58

数据说明蒸馏水处理下能出现少量的微核率，但诱导现象不明显，不能产生显著的毒理效应。

将经过6小时染毒处理的蚕豆根尖微核检出数据列表如表,并计算出各样品微核千分率，算出各品牌样品的各个浓度的平均微核率，用spss软件进行显著性分析，经样品溶液染毒6小时后，各蚕豆根尖的微核检出率相对于蒸馏水处理的微核千分率明显增高。且各溶液的微核率都随着溶液浓度的增加而呈现上升的剂量-效应关系的趋势.从数据中还可以明显看出，同浓度下飘柔溶液染毒的蚕豆根尖微核率明显比其他品牌溶液处理的高，说明洗发水对蚕豆根尖细胞具有遗传毒性效应，且本文中飘柔品牌诱变效应相对较强，洗发水作为一种有机污染物，无论是在人们日常使用过程的直接接触中，还是通过排入到河流湖泊等通过水中生物对人体产生的间接影响，都能对人体健康产生潜在危险性，所以在使用过程中应引起高度关注。

(二)蚕豆根尖细胞微核率与各处理浓度关系分析

将经各检测液处理6小时的蚕豆根尖以平均微核率为纵坐标，浓度为横坐标，将各品牌溶液染毒的数据图绘制如下：

图2 蚕豆根尖平均微核率与处理浓度关系图

由图2可以看出，经检测液处理6小时的根尖平均微核率均呈现随浓度升高而增加的剂量-效应关系，微核是染色体畸变后变现出的一种损伤类型，各种类型染色体畸变是产生微核的主要途径，所以染色体畸变率与微核率具有一定的相关性，由此可以推测洗发水中存在某种能导致蚕豆根尖细胞发生突变的物质，由图也可以看出，飘柔的诱变能力最强，海飞丝跟欧莱雅在低浓度时诱变差异性大，但随着浓度的不断加大，它们的诱变能力趋于一致，而潘婷的诱变能力相比而言，是四者中最低的。

(三)污染指数处理分析

“污染指数”判别可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动，其计算方法如下：

标准：污染指数在0—1.5区间为基本没有污染；

污染指数在1.5—2区间为轻污染；

污染指数在2—3.5区间为中污染；

污染指数在3.5以上为重污染。

凡数值在上、下限值时，定为上一级污染。

将各样品处理的蚕豆根尖细胞平均微核率数据列表如表2，根据污染指数计算方法进行数据处理。依次计算出各浓度各样品的污染指数，并结合污染程度列表如下：

表2 蚕豆根尖经各样品染毒后污染指数与污染程度

将经各检测液处理6小时后的蚕豆根尖细胞以污染指数为纵坐标，浓度为横坐标做图比较如下：

图3 蚕豆根尖细胞经处理污染指数与时间关系图

由表5可以看出，所有样品的污染指数范围为0.6—5.5。处理6小时的样品均受到了一定程度的污染，且飘柔在浓度较低时就能引起较大的污染，欧莱雅引起的污染波动程度不是很大。潘婷跟海飞丝变化的较为明显，从没有受到污染变化到重污染，波动范围大，差异性显著。

四、讨论

蚕豆根尖微核及染色体畸变试验技术近年来逐渐应用于监测环境污染，进行遗传毒理学研究或筛选诱变剂工作[6]，陶少武认为,根尖长度对蚕豆微核试验存在正相关关系,因此在应用微核技术时,应严格筛选材料,尽可能保持初生根长度的一致[7]。

从各品牌溶液微核检出率分析，经洗发水溶液染毒的微核率明显高于用蒸馏水做对照处理的对照组，表明蚕豆根尖在洗发水的诱变下能诱发出较为明显的微核，由此可知，洗发水中存在着某种能使蚕豆根尖细胞产生突变的物质，此外，从各品牌的不同浓度溶液处理后的蚕豆根尖微核检出率分析可以得知，随着浓度的增高，各浓度处理后的蚕豆根尖微核率呈现明显上升的趋势。

从蚕豆根尖细胞微核率与各处理浓度关系的分析图可以看出，飘柔品牌的平均微核率无论在那个浓度都是比其他三个品牌的高，且上升趋势较为平稳。同时还可以看出，海飞丝品牌的上升趋势增长的最快，在不同浓度的微核率波动变化最大，表明不同浓度的微核率存在显著差异，欧莱雅品牌在浓度0.20%之前有一个从上升到下降的变化过程，理论上应该是缓慢上升的，但出现这种结果原因可能是由于镜检过程中，找的计数视野偏离了分生区，从而数得的微核率比正常低，所以导致结果有了一个下降的趋势，潘婷品牌随着浓度的升高微核率也是呈现上升的趋势，但上升的较为缓慢，比较可知，在四种品牌中，潘婷的致蚕豆根尖细胞突变率最低，有关研究指出，蚕豆与小鼠在分类上属于同一个层次，蚕豆染色体的损伤可以在一定程度上反映同样暴露条件下哺乳动物遗传物质的损伤[8，9]，也就是对人体的危害最小，飘柔的致蚕豆根尖细胞突变率最大，对人体的健康影响危害最大。

由蚕豆根尖经各样品染毒后污染指数与污染程度的表格数据明显可以看出，飘柔品牌在浓度0.05%-1.00%是从没有污染到重污染，变化明显；海飞丝品牌也是从没有污染到重污染，同样变化明显；飘柔品牌是从中度污染到重污染，说明在溶液浓度较低时，就已经对微核细胞突变率产生了较大影响，即在浓度较低时，就可以对人体产生较大影响；欧莱雅品牌是从轻污染到重污染，说明在溶液浓度较低时，对细胞突变产生了较小的影响，所以人们在使用此种品牌的洗发水时，对用量应该有一定的控制。

由不同品牌的不同浓度与污染指数柱形图可以看出，在浓度为0.05%时，飘柔的污染指数最大，其次是欧莱雅，潘婷跟海飞丝在浓度较低时，污染指数较小；在浓度为0.10%时，飘柔和海飞丝的污染指数基本相同，其次是潘婷，海飞丝污染指数增加不明显；在浓度为0.25%时，污染指数最大的依旧是飘柔，此时，海飞丝的污染指数有了一个较大的增长，欧莱雅出现了不显著的下降，可能是镜检过程出现的误差，潘婷依旧是略微的增长；在浓度为0.50%时，各品牌都呈现了平稳的上升趋势；在浓度为1.00%时，各品牌都呈现显著的增长趋势；总之，随着浓度的不断上升，污染指数的增加趋势越来越明显。

四种品牌的洗发水致微核率强度比较为：飘柔>欧莱雅>海飞丝>潘婷；其中在浓度较低时潘婷和海飞丝为基本没有污染，飘柔为中度污染，可知潘婷和海飞丝致突变率较低，对人体的健康危害影响最小，飘柔的致蚕豆根尖细胞突变率最大，对人体健康的危害最大，人们在使用时要特别注意使用量。由参阅的大量文献可知，此研究结论与其他研究报道[10][11]相符。