超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中10 种保鲜剂残留量

曹雪琴，杨 飞，陈国通，毛琼玲，李 芳，杨 中,*

（1.新疆维吾尔自治区分析测试研究院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.中国科学院新疆理化技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830011）

果蔬是需求量仅次于粮食的农产品，水果采摘后由于含水量高，不易贮存运输，腐败变质后，不仅营养价值丧失，还会引起食物中毒、资源损失以及环境污染等问题[1]。果蔬保鲜是其贮存、运输、流通过程中必需解决的问题。为保证果蔬的贮藏品质，延长贮藏期限，常在贮运前对果蔬进行保鲜处理，目前常用的保鲜方法有物理保鲜和化学保鲜，物理保鲜包括低温、辐射、臭氧、减压及热处理方式等[2]。与其他保鲜方式相比，化学保鲜剂有设备简单、投资小、成本低、节能降耗等优点，因此在农业生产和农产品贮藏中使用较为广泛。但化学保鲜剂大多有毒性和残留，对人体健康产生不利影响[3]，其使用量与残留量需要保持在一定范围内才能保证食品安全。

苯并咪唑类是高效、广谱的内吸性杀菌剂，对植物病害具有很强的抗菌活性，可用于植物真菌等病虫害的防治[4-5]。常用的苯并咪唑类杀菌剂有苯菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵和多菌灵，基于这些杀菌剂的危害性，美国、日本等国家现已严格控制食品中该类物质的残留量，我国也已将食品中苯并咪唑类杀菌剂的残留量列为重要监测项目。抑霉唑、嘧霉胺是常用的广谱高效杀菌剂，具有强效的抑霉作用，被广泛用于采收后的各种水果和蔬菜，以防止果蔬在运输和贮存过程中腐烂变质，起到防腐保鲜的作用。它们对果蔬中常见的青霉病、绿霉病等有很好的防治作用。

目前针对水果中防腐保鲜剂的检测方法主要有高效液相色谱法[6-11]、气相色谱法[12-14]、气相色谱-质谱联用法[15-18]和液相色谱-质谱联用法[19-29]，研究基质主要为水果和蔬菜。其中抑霉唑[12-14,17-18]、百菌清[30-31]、异菌脲[30-31]等化合物大多采用气相色谱法或气相色谱-质谱联用法检测，鲜见采用液相色谱-串联质谱法同时测定腐霉利、抑霉唑、百菌清、异菌脲。

本实验利用超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析技术，对水果中咪鲜胺、多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵、异菌脲、抑霉唑、苯菌灵、腐霉利、百菌清、嘧霉胺10 种保鲜剂残留量检测方法进行研究，采用QuEChERS方法萃取净化，样品前处理方法操作简单，能够满足水果中10 种保鲜剂残留同时定量分析的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水果样品（葡萄、苹果、红枣）购于市场。

10 种植物保鲜剂标准品：咪鲜胺、多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵、异菌脲、抑霉唑、苯菌灵、腐霉利、百菌清、嘧霉胺（纯度均≥98%） 德国Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；乙腈（色谱纯） 德国Merck公司；甲酸（色谱纯） 美国Tedia公司；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；C18填料（40 μm）、N-丙基乙二胺吸附剂（primary secondary amine，PSA，40 μm） 上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水Milli-Q系统纯化水。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ-MS UPLC-MS/MS仪（配有电喷雾离子源）美国Waters公司；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司；3K15高速离心机 德国Sigma公司；MS3 basic涡旋混合器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液和工作溶液的配制

分别精密称取10 种化合物各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至50.00 mL。此标准溶液质量浓度为0.20 mg/mL，贮存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃下避光保存。作为标准储备液。

精密吸取10 种标准储备液适量，配制混合标准工作液，用甲醇稀释并定容。其中咪鲜胺、多菌灵、噻菌灵、异菌脲、抑霉唑、嘧霉胺质量浓度为0.5 μg/mL，腐霉利、甲基硫菌灵、苯菌灵和百菌清质量浓度为5.0 μg/mL。-20 ℃下避光保存。

分别用相应的水果（葡萄、苹果、红枣）空白基质将标准工作溶稀释，配制成适当质量浓度的混合标准品标准曲线，现配现用。

1.3.2 色谱条件

Waters Acquity UPLC BEHC18色谱柱（100 mmh2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量3.0 μL；流动相A为乙腈；流动相B为0.1%甲酸溶液；洗脱程序：0～4.0 min，30%～90% A；4.0～6.0 min，90% A；6.0～10.0 min，30% A。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式；扫描方式为多反应监测；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气（N2）温度500 ℃；脱溶剂气流量1 000 L/h；锥孔气流量50 L/h；碰撞气（Ar）流速2.5 L/h。在正离子监测模式下，对质谱参数进行优化，见表1。

表1 10 种化合物质谱参数Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 10 analyte compounds

1.3.4 样品前处理

取新鲜水果样品，用粉碎机粉碎混匀，密封冷冻（-20 ℃）保存。

称取试样10 g（精确至0.1 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL含1%乙酸-乙腈溶液，匀浆2 min后，加入4 g无水硫酸镁和1 g醋酸钠，剧烈振摇1 min，于4 ℃、10 000 r/min离心4 min，取上清液5 mL于预先加有75 mg C18、400 mg PSA及1.0 g无水硫酸镁的离心管，涡旋振荡1 min，静置10 min，于10 000 r/min离心5 min，准确吸取1.0 mL上清液于10 mL试管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干，加入1 mL初始流动相复溶，经0.22 μm有机滤膜过滤后，用于测定。

试样液经UPLC-MS/MS分析，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

1.4 数据处理

图谱采集采用MassLynx 4.0，数据处理采用TargetLynx，均为美国Waters公司软件。所有实验数据以平均值表示，采用Excel 2016软件进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在一级质谱全扫描模式下，同时采集正负离子信号，结果发现目标物在正离子模式下的响应值较好。在正离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等质谱参数进行优化，选取碰撞后所得丰度较高的2 个子离子作为特征离子。然后在子离子扫描模式下，选择离子响应最高的子离子作为定量离子，响应次高的子离子作为定性离子，最后在多反应监测模式下，对目标物的碰撞能量进行优化（表1）。其中腐霉利的特征母离子有2 个，分别为[M+H]+（m/z284）及其同位素峰[M+H+2]+（m/z286），且同位素峰的响应较高，因此选择m/z286为定量母离子，m/z284为定性母离子，其产生的子离子均可能为[M-CO]+，腐霉利多反应监测色谱图见图1。

图1 腐霉利多反应监测色谱图Fig. 1 MRM chromatograms of procymidone

2.2 色谱条件的优化

图2 10 种化合物多反应监测色谱图Fig. 2 MRM chromatograms of 10 preservatives

考察甲醇-水、乙腈-水2 种常见流动相体系对目标化合物的影响，结果发现，所有目标化合物在乙腈-水体系中的峰形较好。在流动相中分别添加少量甲酸，能提高目标化合物的离子化效率，并能得到较好的峰形。本实验选用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。10 种化合物多反应监测色谱图见图2。

2.3 样品预处理条件的优化

图3 提取溶剂的回收率Fig. 3 Comparative recoveries of analytes using different extraction methods

以回收率为指标，比较乙腈和1%乙酸-乙腈溶液2 种溶剂的提取效果，如图3所示。以1%乙酸-乙腈溶液为提取溶剂时，回收率普遍高于以乙腈为提取溶剂时的回收率。因此，最终选择1%乙酸-乙腈溶液为提取溶剂。

QuEChERS前处理方法主要应用在果蔬等含水量较多的样品基质中，方法中的净化剂主要有C18、PSA和石墨化碳黑吸附剂（graphitized carbon black，GCB）。C18和PSA的实际应用范围广，对农药的回收率影响小[32-33]。GCB主要去除色素等物质。本研究中所要测试的样品为水果，色素含量较低，因此选择C18和PSA 2 种净化剂，并考察吸附剂对回收率的影响。同时提取后采用较高转速低温离心，上清液比较澄清，能够达到更好的净化效果。按照1.3.4节方法处理对葡萄、苹果、香梨加标样品进行净化，结果表明，经C18和PSA吸附剂净化后，10 种化合物的回收率为70%以上。

图4 溶剂对多菌灵和噻菌灵峰形的影响Fig. 4 Effect of solvents on the chromatographic peak shape of thiabendazole and carbendazim

实验还发现多菌灵和噻菌灵对溶解样品的溶剂比较敏感，当样品经预处理后直接进样分析时，2 个化合物的峰形变宽，会出现双峰，将样品用初始流动相溶解时，峰形明显变好，见图4。因此，样品经净化后，需经氮气吹干后用初始流动相溶解。

2.4 线性范围、检出限和定量限结果

为减小基质效应对定量结果的影响，10 种保鲜剂采用基质匹配-外标法定量分析。分别吸取混合标准工作溶液适量，用空白样品提取液配制标准系列溶液，进样前分析时经氮气吹干后用初始流动相溶解。咪鲜胺、异菌脲、抑霉唑、噻菌灵、嘧霉胺和多菌灵质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、5.0、10、50 ng/mL；甲基硫菌灵、苯菌灵、腐霉利和百菌清质量浓度分别为5.0、10、50、100、500 ng/mL；经UPLC-MS/MS分析，采用外标法建立标准曲线。以质量浓度为横坐标（x，ng/mL），定量离子对峰面积为纵坐标（y），进行线性回归计算，所得相关系数均大于0.99，线性良好，以3 倍信噪比估算检出限，以10 倍信噪比对应质量浓度作为定量限，结果见表2。

表2 10 种保鲜剂的线性方程、相关系数、检出限、定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 10 preservatives

2.5 回收率与精密度结果

对葡萄、苹果、红枣3 种样品进行添加回收和精密度实验。进行低、中、高3 个添加水平的回收实验，加标量分别为10、20 μg/kg和30 μg/kg，结果见表3。

表3 10 种保鲜剂的回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 10 preservatives in three real samples (n= 6)

2.6 实际样品检测结果

采用优化建立UPLC-MS/MS快速分析方法对市售葡萄、苹果、红枣等50 份样品进行测试。结果显示，咪鲜胺检出样品1 个，为红枣，检出值为7.2 μg/kg；甲基硫菌灵检出样品1 个，为红枣，检出值为4.4 μg/kg；百菌清检出样品1 个，为红枣，检出值为113 μg/kg；嘧霉胺检出样品1 个，为葡萄，检出值为16.2 μg/kg；多菌灵检出样品2 个，均为葡萄，检出值为1.77 μg/kg和1.10 μg/kg；每个品种抽出1 份样品加入添加量为10 μg/kg的标准溶液以测定加标回收率考察方法的可靠性和稳定性，10 种化合物的平均回收率为75.0%～112%，相对标准偏差为3.0%～9.5%，完全满足分析要求。

3 结 论

本实验建立了UPLC-MS/MS法测定水果中10 种植物保鲜剂残留量的检测方法。结果表明：该方法操作简单，结果准确、重复性好，该方法可同时测定10 种保鲜剂残留量，且具有操作简单、回收率高、精密度好、灵敏度好等特点，满足果蔬中农药残留量的分析要求，可为政府行政监督提供检测技术支持。应用于日常检测中可降低检测成本，缩短检测周期，具有实际应用价值。