基于脂质组学法对母乳、牛乳及羊乳脂质的差异分析

张宏达，王立娜，张 宇，李晓东,*，冷友斌，巩燕妮，蒋士龙

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150030；4.黑龙江完达山林海液奶有限公司，黑龙江 牡丹江 157100）

母乳中的脂质是婴儿最重要的营养物质来源之一，其主要包括甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diglyceride，DG）、游离脂肪酸、胆固醇等中性脂质和甘油磷脂、鞘脂、糖脂等极性脂质[1]，它们不仅在婴儿出生的前6 个月中为婴儿提供其所需的40%～50%的能量[2]，还是参与婴幼儿脑部、视力发育及器官快速生长和生物膜合成的重要营养成分[3-5]。母乳作为婴儿出生前6 个月中全部营养物质的来源，可以满足婴幼儿生长发育的全部脂类需求，但可能由于母亲身体健康状况等原因，母乳喂养并不能完全实现。为使作为母乳替代品的婴幼儿配方奶粉达到与母乳尽可能相似的生理功能，对母乳及其替代品原料的脂质组分进行完整分析具有重要意义。

脂质组学是一门对生物体系脂质进行全面系统分析的研究学科[6]，利用先进仪器设备实现对给定基质中存在的脂质进行快速、高通量的分析鉴定是其重要研究内容之一。虽然脂质组学在生物学研究中的应用呈指数增长，但其在乳脂质研究方面仍处于起步阶段[7]。多年以来，薄层色谱、气相色谱等基础分析手段都已经被用于研究乳脂质组成[8-9]，而近期随着色谱与质谱、核磁共振谱联用等分析技术的发展，为乳脂质组学的研究提供了更加多样且可靠的技术手段。迄今为止，具有高分辨率和高通量特性的液相色谱-质谱联用法已经成为脂质组学分析中最常用的技术手段[1]。Beccaria等[10]开发了一种利用液相色谱-质谱联用技术高效检定乳中TG的方法，并对母乳、牛乳及羊乳的TG组成进行了分析，分别鉴定出了136、165 种及141 种TG。Kallio等[11]利用超高效液相色谱-质谱联用法对中国和芬兰地区母乳中TG组分进行了分析，共检出了300余种TG结构；何杨波等[12]利用超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱法对中国东北地区母乳磷脂的组成进行了分析，从母乳中检出磷脂共计60 种。虽然目前对于母乳及其他乳的脂质成分测定的研究已经有所进展，但大多数研究都是针对单一脂质种类进行的，对母乳及其他乳类进行的全脂质研究十分稀少且方法陈旧[13-14]，更鲜有从组学层面进行的全脂质组分研究。这使得目前关于母乳及一些作为母乳替代品的脂质组成研究非常分散，难以形成描述母乳及其替代品脂质组成的完整体系。

本研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight-mass spectrum，UPLC-QTOF-MS）联用技术，对母乳、牛乳及羊乳的脂质组成进行表征，并通过单变量统计分析手段分析3 种乳中脂质组成差异，以期为丰富中国母乳数据库提供数据支撑，为婴幼儿配方奶粉脂质母乳化及乳脂质组学的进一步发展提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳采集自吉林省松原市的成熟健康母乳（（30f1）d），年龄20～25 岁，分娩健康足月儿，母乳充足，哺乳期间不吸烟、不饮酒，孕期或哺乳期间无乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、精神系统疾病、癌症及其他恶性消耗性疾病，最近2 周没有使用过药物及催乳用西药，并填写知情通知书；牛乳及羊乳采集自黑龙江省五常市。样品采集后分装在已编码的10 mL冻存管中，于—20 ℃冰箱中保存，直至使用。

1-十五烷酰基-2-油酰基(D7)磷脂酰乙醇胺（1-pentadecanoyl-2-oleoyl(D7)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin，D7-PE）、1-油酰基(D7)-2-羟基磷脂酰胆碱（1-oleoyl(D7)-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine，D7-LPC）、1,3-二十五烷酰基-2-油酰基(D7)甘油三酯（1,3-dipentadecanoyl-2-oleyol(D7)-glycerol，D7-TG）标准品 美国Avanti 公司；甲醇、甲基叔丁基醚、乙腈（均为色谱纯） 德国CNW Technologies公司；醋酸铵、氨水、二氯甲烷、异丙醇（均为色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

1290 UPLC仪 美国Agilent公司；Triple TOF 6600型高分辨质谱（配备Analyst TF 1.7控制软件） 美国AB Sciex公司；Heraeus Fresco17冷冻微量离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；超声仪 深圳雷德邦电子有限公司；超纯水系统 德国Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

分别取母乳、牛乳及羊乳乳样各6 份，进行脂质提取；通过UPLC-QTOF-MS方法对3 种乳中脂质种类及含量进行测定后，对3 种乳中脂质组成进行差异分析。

1.3.2 样品处理

脂肪提取：取60 μL样品，加入340 μL H2O，加960 μL 5∶1（V/V）的甲基叔丁基醚-甲醇（含10 μL 10 μg/mL D7-PE（15∶0/18∶1），5 μL 100 μg/mL D7-L P C（1 8∶1），1 1 μ L 1 0 0 μ g/m L D7-T G（15∶0/18∶1/15∶0））；涡旋振荡60 s，超声处理10 min；4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液500 μL；重新加入500 μL甲基叔丁基醚，重复提取2 次，合并3 次上清液，在旋转蒸发仪下吹干；吹干后样品用100 μL 1∶1（V/V）的二氯甲烷/甲醇复溶；取60 μL上清液于2 mL进样瓶，上机检测[15]。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Phenomen Kinetex 1.7u C18100A Column（100 mmh2.1 mm）；流动相A：10 mmol/L醋酸铵+40% H2O+60%乙腈；流动相B：10 mmol/L醋酸铵+10%乙腈+90%异丙醇；流速300 μL/min。洗脱条件：0～12 min，60% A；12～13.7 min，0% A；13.7～18 min，60% A；进样量2 μL[16]。

1.3.4 质谱条件

在控制软件控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，采集强度最强且大于100的分子离子对应的二级质谱数据。轰击能量：35 eV，每50 ms采集15 张二级谱图。电喷雾离子源参数设置为：雾化气压（GS1）60 Pa；辅助气压60 Pa；气帘气压30 Pa，温度550 ℃；喷雾电压5 500 V[16]。

1.4 数据处理

使用ProteoWizard软件将原始质谱转化为mzXML格式。再使用XCMS软件进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。使用基于XCMS软件、R程序包及脂质二级数据库进行脂质鉴定及定量工作；使用SPSS 23.0和Simca 14.1软件对数据进行差异分析和单变量统计分析。

2 结果与分析

2.1 母乳、牛乳及羊乳脂质组成

图1为母乳、牛乳及羊乳基于UHPLC-QTOF-MS法在正离子模式下扫描得到的总离子流图谱，表1为在3 种乳中鉴定出的脂质种类及含量。如表1所示，本研究从3 种乳中均检出脂质103 种，其中包括磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines，PC）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、神经酰胺（ceramide，Cer）及己糖苷神经酰胺（hexosylceramides，HexCer）4 类极性脂质和TG、DG 2 类中性脂质。但脂质中常见的其他3 类极性脂质磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸在本研究中未检测到。这可能是由这些极性脂质分子在离子化时所带电荷导致的[17]。

图1 母乳（a）、牛乳（b）及羊乳（c）总离子流图Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of human (a), bovine (b)and caprine milk (c)

表1 母乳、牛乳及羊乳中脂质种类及含量（n＝6）Table 1 Types and concentrations of lipids identi fi ed in human,bovine and caprine milk (n= 6)

续表1

2.2 母乳、牛乳及羊乳极性脂质差异分析

如图2所示，母乳含量最高极性脂质种类是SM（468.82 μg/mL），其次是Cer（422.98 μg/mL），而后则是PC（62.587 μg/mL）与HexCer（22.57 μg/mL），母乳中高含量的SM已经被一些研究证实，但关于母乳中Cer的高含量研究很少[18-19]，Cer既是合成SM的前体也是SM的分解产物[20]，二者在母乳中的高含量可能存在对应关系。在母乳不同的脂质类别中（表1），PC主要与饱和脂肪酸相连，其中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）是含量最高的PC种类，共占母乳PC含量的58%，这与Yao Yunping等[19]的结论有所出入，可能是由于含不饱和脂肪酸的PC在离子化时主要以阴离子形式存在导致的；母乳中的主要Cer则是Cer（d18∶1/22∶0）、Cer（d18∶1/24∶1）和Cer（d18∶1/24∶0），母乳总Cer约61%；母乳中含量最高的SM种类为SM（d16∶0/26∶1），质量浓度高达317.2 μg/mL，占母乳总SM含量的67%，其次为SM（d14∶1/26∶1），含量为44.98 μg/mL；此外，本研究鉴定出的母乳中3 种HexCer里，HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）是其中的主要HexCer种类。

图2 母乳、牛乳及羊乳中各类极性脂质总质量浓度Fig. 2 Total contents of different classes of polar lipids in human,bovine and caprine

与母乳相似的是，牛乳极性脂质质量浓度同样遵循SM（22.46 μg/mL）＞Cer（12.46 μg/mL）＞PC（5.42 μg/mL）＞HexCer（5.06 μg/mL）的趋势。具体种类中，PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-20∶0/20∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）是牛乳中主要的PC种类，占牛乳中PC的54%；Cer（d18∶1/16∶0）及Cer（d18∶1/22∶0）则是牛乳中主要的Cer种类；牛乳中主要SM种类为SM（d15∶0/24∶1）、SM（d14∶0/20∶0）及SM（d14∶0/18∶1），共占牛乳中SM的54%；牛乳中含量最高的HexCer种类则与母乳相同，为HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）。

与母乳及牛乳不同，在羊乳中Cer（625.91 μg/mL）是含量最高的极性脂质种类，其次为SM（555.93 μg/mL）和H e x C e r（1 7 5.5 1 μ g/m L），而P C含量最低（105.65 μg/mL），这一结果与Castro等[21]的研究结果有所差异，可能与羊品种及饲喂方式有关。羊乳中PC（P-20∶0/18∶0）、PC（P-16∶0/2∶0）及PC（P-20∶0/9∶0）3 种PC的含量远高于其他种类PC，C20:0、C16:0及C18:0是其含量最高的3 种脂肪酸；Cer（d18∶1/16∶0）是羊乳中含量最高的Cer类型，占其总Cer的47%；羊乳中主要SM种类则为SM（d16∶0/26∶1）、SM（d15∶0/24∶1）和SM（d14∶0/18∶1），共占羊乳中SM的48%；羊乳中HexCer种类同样以HexCer（d17∶0/24∶1）和HexCer（d18∶1/16∶0）为主，占羊乳中HexCer的98%以上。

对比3 种乳中极性脂质含量可以发现，母乳中极性脂质含量低于羊乳，而显著高于牛乳（P＜0.05），与其他研究中结论有所出入，这与牛乳产地差异或饲料差异有关[17-18]。另外，母乳中SM连接的超长链脂肪酸比例远高于牛乳及羊乳。包含超长链脂肪酸的SM是构成脂肪球膜上脂阀结构的主要物质，这种特殊结构构成了微生物、细菌、病毒的特定黏附位点，是乳脂肪球膜的杀菌功能的重要来源[22]，母乳中高含量的超长链脂肪酸SM可能意味着母乳脂肪球在抗菌功能上强于牛乳和羊乳。

对不同乳的极性脂质进行单变量统计分析，筛选变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP，表示每个物质对差异所起的贡献值）大于1、P值小于0.05的脂质为2 种乳间差异脂质，结果见表2。发现牛乳与母乳间具有显著差异的极性脂质共有11 种，主要为SM类，其中SM（d14∶0/20∶0）与SM（d15∶0/24∶1）2 种在母乳中含量较高且差异最为显著。此外牛乳在3 种HexCer上与母乳间都存在显著差异（VIP＞1，P＜0.05），而研究表明HexCer是生物体各种膜结构的重要组分，在细胞表面发生的跨膜信号转导中起重要作用[23]，这一作用与人体免疫应答、细胞发育、细胞识别及分化有着重要关联[24]，因此，在以牛乳为基料制备婴幼儿配方奶粉时，对HexCer成分的调整可能会具有重要意义。羊乳与母乳间存在显著差异的极性脂质只有PC（26∶0/0∶0）一种，而牛乳与羊乳在磷脂方面不存在显著差异种类。整体来看，在极性脂质组成方面，羊乳与母乳间差异较牛乳与母乳间更小，更适合用于生产母乳替代品。

表2 母乳、牛乳及羊乳中具有显著差异的极性脂质种类Table 2 Polar lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

2.3 母乳、牛乳及羊乳中性脂质差异分析

如图3所示，母乳中DG含量与其他组分相比相对较高（38 405.11 μg/mL），甚至高于母乳中TG含量（9 344.29 μg/mL），该结果与早期研究存在一定差异，本研究中所用方法检测到的DG种类远多于其他研究，而TG种类相对较少。这可能是导致结果存在差异的主要原因[25-26]。由表1可知3 种乳中中性脂质的具体组成情况，DG（18∶2/18∶2）是母乳中含量最高的DG种类，质量浓度高达18 552.24 μg/mL，占母乳中DG的48%；TG（16∶0/18∶1/18∶2）、TG（16∶0/18∶0/18∶1）、TG（18∶1/18∶2/18∶2）则是母乳中主要的TG种类，共占母乳TG的65%。牛乳中，TG质量浓度（9 236.37 μg/mL）则远高于DG（386.54 μg/mL），主要DG种类为DG（16∶0/16∶0）、DG（18∶1/18∶1），二者共占牛乳中DG含量的46%，牛乳TG中则是TG（16∶0/18∶0/18∶1）质量浓度最高（3 263.08 μg/mL）。羊乳DG质量浓度（5 043.48 μg/mL）则与TG相对接近（6 284.82 μg/mL），其中DG（18∶1/18∶1）约占羊乳DG总量的40%，而TG（16∶0/18∶0/18∶1）则约占羊乳TG含量的34%。通过对比可以看出，母乳中DG含量显著高于牛乳及羊乳（P＜0.05），这可能是致使母乳喂养婴儿肥胖率相对较低的原因之一[27-28]。

图3 母乳、牛乳及羊乳中中性脂质总质量浓度Fig. 3 Total contents of different classes of neutral lipids in human,bovine and caprine milk

通过单变量统计分析，筛选3 种乳中具有显著差异（VIP＞1，P＜0.05）的中性脂质种类，结果见表3。其中牛乳与母乳间具有显著差异的脂质种类最多，包括12 种DG和13 种TG，而羊乳中与母乳具有显著差异的DG只有DG（20∶2/20∶2），TG则有12 种；牛乳与羊乳的中性脂质组成相对接近，仅有3 种TG存在显著差异（VIP＞1，P＜0.05）。可以看出，牛羊乳与母乳存在显著性差异的中性脂质主要为TG，且TG（17∶2/18∶0/20∶5）在3 种乳中都存在显著性差异（VIP＞1，P＜0.05）。此外，牛乳和羊乳在TG（12∶0/12∶0/16∶1）、TG（12∶0/12∶0/16∶0）、TG（12∶0/18∶1/16∶1）3 种中链脂肪酸甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT）上都与母乳存在显著差异（VIP＞1，P＜0.05）。MCT较容易被人体吸收且对改善糖、脂、胆固醇代谢有一定积极作用[29-30]，牛乳及羊乳在MCT上与母乳的差异可能会对婴幼儿生长发育具有潜在的影响。此外，母乳中含有亚油酸（C18:2）的DG和TG含量显著高于牛乳和羊乳（P＜0.05），这一趋势与母乳中亚油酸含量远高于牛乳及羊乳的趋势相似[31]。而亚油酸在婴儿视力、智力发育、预防过敏等方面具有重要作用[32]，牛乳与羊乳在亚油酸上与母乳的巨大差异是十分值得注意的。

表3 母乳、牛乳及羊乳中具有显著差异的中性脂质种类Table 3 Neutral lipids that significantly differed among human,bovine and caprine milk

3 结 论

通过母乳、牛乳及羊乳脂质组成的全面定性定量分析发现，牛乳与母乳间具有显著性差异的脂质种类多达36 种，主要集中在TG、DG和SM；而羊乳与母乳间具有显著差异的脂质种类相对较少，为14 种，主要集中在TG。母乳中的主要极性脂质为SM，且SM（d14∶0/20∶0）与SM（d15∶0/24∶1）含量显著高于牛乳，而与羊乳无显著差异；此外牛乳HexCer与母乳存在显著差异，对婴儿免疫应答及发育具有潜在影响；中性脂质方面，母乳中DG含量显著高于牛羊乳（P＜0.05），这种差异对减少婴儿肥胖的发生有一定作用。从脂质组成角度来看，羊乳与母乳间的差异比牛乳与母乳更小。本研究揭示了母乳、牛乳和羊乳脂质组成和差异情况，丰富了我国母乳研究数据，并为婴幼儿配方奶粉中脂质的优化和调整提供了更多参考依据。