搅拌棒吸附萃取结合气相色谱-质谱联用技术分析西湖龙井茶的挥发性成分

王梦琪，朱 荫*，张 悦，施 江，林 智，吕海鹏*

（1.农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

香气是评价茶叶品质的重要因子之一。茶香实际上是不同的芳香物质通过不同浓度组合，并对嗅觉神经综合作用所形成的茶叶特有的香型[1]。迄今为止，人们从茶叶挥发性成分中鉴定出的香气物质已多达700余种，主要包括醇类、醛类、酸类、酯类、酚类以及杂环类化合物等[2]。茶叶香气成分的类型复杂，既有来源于茶树品种本身的香气物质，又包括加工过程中化学反应及微生物代谢生成的香气物质，香气物质类型及含量的差异在很大程度上影响着茶叶的风味品质。长期以来，人们开展了大量的茶叶香气成分的分析检测工作，已经取得了较好的研究进展。

目前，茶叶香气物质的分析一般包括香气成分的富集和香气成分的定性定量分析等。在茶叶香气的富集方面，目前人们广泛采用的方式主要有吹扫捕集（purge &trap，P&T）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）、减压蒸馏萃取、同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、顶空蒸汽蒸馏萃取等[3-7]。近年来，搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）方法逐渐引起人们的关注，SBSE作为一种新型的样品前处理技术[8]，其原理与SPME法类似，都以吸附涂层富集样品中的挥发性成分；但不同的是，SPME技术多采用顶空方式萃取香气物质，而SBSE技术则主要采用浸没方式与样品直接接触吸附香气物质。SBSE的富集倍数取决于被测物质在萃取涂层上的吸附量，由于SBSE搅拌棒上的涂层吸附量是SPME的50～250 倍，因此，其富集倍数较SPME高[9]。聚二甲氧基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）和聚乙二醇-硅树脂（ethylene glycol-silicone，EG-Silicone）是目前SBSE技术中使用较为普遍的2 种吸附涂层，PDMS主要吸附非极性化合物和极性较弱的化合物，EG-Silicone则主要吸附极性化合物。研究表明，SBSE作为一种环境友好型萃取技术[10]，具有良好的重复性，且能够降低样品分析的检测限[11-12]；目前，该技术已经广泛应用于水体污染物的检测[13]、果酒[14]、烟草[15]等行业的香气物质检测。因此，可以推断SBSE技术在茶叶香气成分的研究领域可能具有很大的优势和潜力，然而目前尚无系统的相关研究报道。

西湖龙井茶作为我国典型的地理标志茶类产品，素以“色翠、香郁、味醇、形美”四绝闻名中外[16]，其香气品质高鲜清幽，清香显著，长期以来备受国内外消费者的喜爱[17]。现有研究已有较多关于西湖龙井茶香气成分的分析报道，采用的香气成分萃取方法种类繁多，主要包括SPME、SDE、P&T等[18-20]。基于此，本研究拟选用西湖龙井茶为研究对象，采用SBSE方法富集其香气成分，同时结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对萃取条件进行优化，分析研究西湖龙井茶的香气成分组成及含量水平等，并与其他萃取方式的研究结果进行比较分析，以期为SBSE方法在茶叶香气分析中的应用提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西湖龙井茶样品5 个，由杭州龙冠实业有限公司于2018年制作；根据GB/T 18650ü2008《地理标志产品龙井茶》，进行香气感官审评，发现这5 个样品香气品质优异，“清香”显著，具有较好的代表性。从上述5 个茶样中各取5.00 g，均匀混合后磨成茶粉，制成标准混合茶粉。

正构烷烃（C3～C7、C8～C40） 北京百灵威公司。

1.2 仪器与设备

6890-5975 GC-MS联用仪、HP-5ms色谱柱（30 mh250 μm，0.25 μm）（配有GC进样口的热脱附单元和冷进样口） 美国Agilent公司；PDMS及EGSilicone涂层磁力搅拌棒（10 mmh0.5 mm，24 μL）德国Gerstel公司；Advanced Multipoint 6/15多位点磁力搅拌器 美国Thermo Fisher公司；AB104-S电子分析天平瑞士梅特勒-托利多集团。

1.3 方法

1.3.1 热脱附系统条件

溶剂排空模式，初始温度30 ℃，保留1 min，以100 ℃/s速率升温至240 ℃，并在此温度下保持5 min。

1.3.2 冷进样系统条件

液氮冷却至-100 ℃，升温程序：-100 ℃平衡1 min，以12 ℃/s升温到280 ℃，保持3 min。保留时间3 min。

1.3.3 GC-MS测定条件

GC条件：HP-5ms色谱柱（30 mh250 μm，0.2 5 μ m）；程序升温：5 0 ℃保持2 m i n，以4 ℃/min的速率升至170 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min升至265 ℃，保持5 min。载气（He）流速为1.6 mL/min，溶剂排空模式。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围33～600 u。

1.3.4 SBSE优化方法

实验采用吸附材料不同的2 种搅拌棒PDMS、EG-Silicone，使用前将搅拌棒置于热脱附进样口中老化45 min。取标准混合的西湖龙井茶粉400 mg，置于20 mL样品瓶中，10 mL沸水冲泡，平衡1 min后放入搅拌棒，置于多位点磁力搅拌器上搅拌吸附60 min，吸附结束后，取出搅拌棒，用超纯水冲洗后再用滤纸吸干水分，后将搅拌棒置于热脱附装置中解吸附，进行GC-MS分析。

1.3.5 单因素试验

采用单因素方法研究搅拌棒类型（PDMS和EGSilicone）、萃取温度（60、70、80、90 ℃和100 ℃）、萃取时间（30、50、70、90 min和110 min）、转速（250、500、750、1 000 r/min和1 250 r/min）、NaCl溶液质量分数（0%～30%）、茶水比（20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1（mg/mL））各因素对SBSE优化结果的影响，试验以化合物总峰面积作为考察指标。设置3 组重复，结果取平均值。

1.3.6 正交试验优化

根据单因素试验结果，选取3 个对SBSE效果影响最大的因素，设置3因素3水平的正交试验L9（33）（表1），确定SBSE的最优萃取条件参数。

表1 SBSE正交试验因素与水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of SBSE parameters used in orthogonal array design

分析结果采用NIST 14标准谱库检索结合正构烷烃计算进行香气化合物的定性；采用峰面积归一法，即各个化合物的峰面积与总峰面积间的比值计算，对各个化合物进行相对定量分析。

2 结果与分析

2.1 各因素对SBSE萃取效率的影响

2.1.1 搅拌棒类型对萃取效果的影响

研究表明，PDMS作为非极性涂层，具有较好的热稳定性及良好重复性，但对于低亲和力的高极性化合物吸附效果较差[21]；EG-Silicone涂层对于一些极性较高、解吸温度较低的化合物具有遗留效应，导致化合物难以解吸附[22]。本实验为考察西湖龙井茶香气成分分析适用的萃取涂层类型，对以上2 种应用较为广泛的搅拌棒涂层进行比较。称取标准混合茶粉400 mg，按上述方法冲泡后分别用PDMS和EG-Silicone 2 种搅拌棒进行萃取，结果表明，PDMS涂层搅拌棒萃取得到的化合物总峰面积为2.50h108，化合物数量为149；EG-Silicone涂层搅拌棒萃取得到的化合物总峰面积为7.89h107，化合物数量为82，对比发现，PDMS涂层萃取得到的化合物总峰面积有EG涂层的3 倍之多，萃取得到的化合物数量接近EG涂层的2 倍。统计分析结果表明2 种搅拌棒的萃取效率之间存在显著性差异（P＜0.05），因此，PDMS的萃取效果最佳。

2.1.2 茶水比对SBSE萃取效果的影响

图1 茶水比对SBSE萃取效率的影响Fig. 1 Effect of tea-to-water ratio on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

茶汤的浓度关系到茶汤的黏度，进而影响搅拌棒的搅拌运动。分别称取不同质量的标准混合茶粉（200、400、600、800 mg和1 000 mg）进行香气成分的萃取吸附。如图1所示，茶水比为40∶1（mg/mL）条件下，具有最大的总峰面积；统计学分析表明，40∶1与60∶1、80∶1、100∶1之间无显著差异（P＞0.05），但过高的浓度将导致茶汤黏稠度的增加，进而影响搅拌棒的工作效率。因此，茶水比在40∶1（mg/mL）左右时SBSE的萃取效率最佳。

2.1.3 萃取时间对SBSE萃取效果的影响

图2 萃取时间对SBSE萃取效率的影响Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

搅拌棒吸附萃取过程中，样品萃取时间过短使得挥发性香气成分无法达到顶空、茶汤及吸附相三者之间的平衡，萃取时间过长则会引起香气成分在搅拌棒吸附相上的位点竞争，导致化合物含量不准确[23]。如图2所示，30、50 min与70、90、110 min萃取时间存在显著性差异（P＜0.05），当萃取时间为90 min时茶汤、顶空及吸附相中的香气成分基本达到平衡，萃取效率基本达到最佳，而后随着萃取时间的延长（110 min）并未使总峰面积产生显著提高，因此，90 min的萃取时间为最佳萃取时间。

2.1.4 萃取温度对SBSE萃取效率的影响

图3 萃取温度对SBSE萃取效率的影响Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

如图3所示，萃取温度60～80 ℃，香气成分的总峰面积有明显的上升趋势，到80 ℃时香气成分总峰面积达到最大；而后，随着温度的继续上升，香气成分的总峰面积则显著下降，统计分析结果表明80 ℃时化合物的总峰面积与60、70、90、100 ℃之间存在显著性差异（P＜0.05），推测过高的温度可能使香气成分大量逸出，同时导致搅拌棒上香气化合物解吸附。因此，80 ℃的萃取温度为最佳萃取温度。

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2.1.5 搅拌棒转速对SBSE萃取效果的影响

研究表明，前处理过程中的搅拌可以有效提高萃取效率，减少萃取时间[24]。如图4所示，高转速（1 250、1 000 r/min）与低转速（250、500、700 r/min）间存在显著性差异（P＜0.05），但1 250 r/min与1 000 r/min间差异不显著（P＞0.05）；1 000 r/min转速条件下分析得到的化合物具有最大总峰面积，推测1 000 r/min搅拌条件下，最有利于香气成分从水相中的溶解，从而更好地被搅拌棒涂层吸附；因此，考虑到适中的转速又可以避免搅拌棒与样品瓶底机械摩擦过度造成的机械损伤，因此，转速为1 000 r/min左右时最有利于SBSE的香气萃取。

图4 转速对SBSE萃取效率的影响Fig. 4 Effect of agitation rate on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

2.1.6 NaCl溶液质量分数对SBSE萃取效果的影响

图5 NaCl溶液质量分数对SBSE萃取效率的影响Fig. 5 Effect of NaCl concentration on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

在西湖龙井茶香气化合物萃取过程中加入NaCl可促进香气物质的挥发，主要是由于NaCl产生的盐析作用能够有效降低极性香气成分在水相中的溶解度，促进极性香气成分向气相扩散，从而提高PDMS的萃取效率[25]。如图5所示，当NaCl溶液质量分数为5%、20%与25%时，总峰面积较高，与其他质量分数之间存在显著性差异（P＜0.05）。然而，也有文献报道称，过高的NaCl溶液质量分数增大了溶液黏度，从而导致萃取效率减小[22]。因此，质量分数5%左右的NaCl溶液最有利于SBSE的香气萃取。

2.2 SBSE萃取参数的正交试验优化

单因素试验分析结果表明，转速、NaCl溶液质量分数及茶水比这三者水平的变化对萃取效率影响变化较大。因此，根据正交试验设计原理，以化合物总峰面积值作为参考指标设计3水平3因素的正交试验，极差及方差分析结果如表2、3所示。

表2 SBSE正交试验设计结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 SBSE正交试验方差分析Table 3 Analysis of variance of the effect of SBSE parameters on the extraction efficiency

由表3可知，转速、NaCl溶液质量分数及茶水比对SBSE萃取效率的影响均不显著（P＞0.05），而极差分析结果（表2）表明，5号试验组结果具有最大的总峰面积平均值，即组合为A3B2C3时，SBSE方法具有最佳萃取效率。同时，极差分析结果表明3 个因素对SBSE萃取效率的影响为茶水比＞转速＞NaCl溶液质量分数。经过验证，选择A3B2C3为最佳实验组合，即转速1 250 r/min、质量分数5% NaCl溶液以及60∶1（mg/mL）的茶水比。结合单因素分析的优化结果，最终，选定PDMS转子、60∶1（mg/mL）的茶水比、80 ℃萃取温度、90 min萃取时长以及质量分数5% NaCl溶液为本实验中SBSE的最优萃取方法。

2.3 方法有效性验证

使用优化后的SBSE方法对标准混合茶粉重复5 次萃取，计算化合物总峰面积及5 次重复之间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），对方法的重复性进行验证；利用西湖龙井茶中含量较高、带有显著清香特征的正己醛计算实验方法的加标回收率，在2 组标准混合茶粉中分别定量加入2 种不同质量浓度的正己醛标准溶液10 μL（84.315 0、42.157 5 μg/mL），而后采用已优化后的SBSE-GC-MS方法对其进行萃取分析，通过软件定性、峰面积计算后，按照加标回收率公式计算，对SBSE实验方法的有效性进行验证。

表4 正己醛的加标回收率检测结果Table 4 Recoveries of n-hexanal in spiked tea

结果表明，5 次样品重复的化合物总峰面积之间的RSD为8.23%。加标回收率测定结果如表4所示，高添加量条件下（0.843 2 μg），该方法对正己醛的回收率为115.11%；低添加量条件下（0.421 6 μg），该方法对正己醛的回收率为108.99%，均在80%～120%之间，且RSD均小于10%（n=3），说明该方法的重复性及准确度良好，适用于西湖龙井茶的香气分析。

2.4 西湖龙井茶挥发性香气成分分析

表5 西湖龙井茶挥发性香气成分SBSE-GC-MS分析结果Table 5 Volatile aroma compounds of “XihuLongjing” tea identi fi ed by SBSE-GC-MS

续表5

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通过谱库检索并结合正构烷烃，对最优组合茶样进行分析，由表5可知，共定性出173 种共有香气成分，其中，相对含量较高的化合物有正己醛、苯甲醛、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、芳樟醇及其氧化物、香叶醇、吲哚、反-β-紫罗兰酮等。

图6 西湖龙井茶中挥发性香气化合物种类及其相对含量Fig. 6 Kinds and relative contents of volatile aroma compounds in“XihuLongjing” tea

根据香气成分化学结构的差异，对检测得到的西湖龙井茶中挥发性香气成分进行分类，各类别化合物的数量和相对含量如图6所示。可见，通过SBSE-GC-MS分析得到的西湖龙井茶香气化合物主要包含烯醇类3 种（1.80%）、烯类11 种（3.99%）、烷烃类37 种（16.07%）、醛类15 种（8.96%）、烯醛类4 种（3.34%）、醚类2 种（0.07%）、醇类17 种（21.85%）、酯类22 种（8.65%）、内酯类5种（3.14%）、烯酯类9 种（1.57%）、烯酮类5 种（2.15%）、酮类16 种（6.36%）、有机酸类3 种（0.86%）、含硫化合物3 种（0.24%）、氮杂环化合物3 种（0.52%）、氧杂环化合物3 种（3.61%）、芳香烃15 种（6.66%）。烷烃、酯类及醇类化合物是西湖龙井茶中化合物种类最多的成分，相对含量较高的烷烃类物质有2,2,4,6,6-五甲基庚烷、十四烷。十四烷带有微弱蜡烛气味，对绿茶的香气类型具有关键作用[26]；水杨酸甲酯（冬青油气味）、邻苯二甲酸二异丁酯（微具芳香气味）是相对含量较高的酯类物质，它们也是西湖龙井中含量较高的化合物[27]；芳樟醇和香叶醇是含量较高的醇类物质，SBSE-GC-MS方法检测到的西湖龙井茶样品中芳樟醇的相对含量为2.06%，而香叶醇的相对含量则达到了13.60%。芳樟醇是茶叶中重要的香气物质之一，具有木香、花香特征[28]；香叶醇具有玫瑰花香、蔷薇香，也是西湖龙井茶中的典型香气成分[27]。有研究表明，香叶醇与芳樟醇、壬醛、癸醛、β-环柠檬醛等成分一起，对构成绿茶的特征风味同样具有重要作用[29]。

对比近年来有关西湖龙井茶香气萃取方法的研究报道，可以发现不同香气萃取方法分析得到的西湖龙井香气成分之间也存在较大差异。例如，汪厚银等[20]采用了微阱捕集法（动态顶空）萃取方法结合GC-MS对西湖龙井茶进行了香气成分分析，共检测出了43 种香气成分，主要香气成分中烯烃类14 种、醇类9 种、酮类6 种、醛类4 种、杂环类4 种以及硫化物2 种；孙彦等[29]对6 种龙井茶进行SDE-GC-MS分析，共分离出100 个峰，鉴定得到了62 种香气成分，并发现西湖产区的龙井茶香气总量占绝对优势；代毅等[30]采用SPME结合GC-MS技术从西湖龙井茶种鉴定出26 个组分，同时发现己酸-反-2-己烯酯是其西湖龙井样品中含量最高的成分；此外，肖作兵等[7]采用HS-SDE提取西湖龙井茶的香气成分，该研究共鉴定出75 种香气成分，包括醇类24 种、醛类8 种、酮类10 种、酯类6 种、杂环类16 种及其他类11 种。

分析近年有关西湖龙井茶的香气研究报道存在差异的原因，与不同的萃取方法有直接的关系，这些方法均具有各自优点，也都存在萃取效果及实验操作上的不足。例如，吹扫捕集方法不需要有机试剂，同时污染小，操作简单，但其主要针对低沸点挥发性组分的富集[31]；减压蒸馏萃取法方法可以较好还原茶汤的香气，但回收率较低[32]；SPME同样具有分析样品用量少，方法简单、快速、费用低等优点，且SPME的萃取涂层种类丰富，选择性较高，在肉类以及乳制品风味研究中应用广泛[33-34]；但由于SPME萃取头吸附相体积的限制，SPME吸附的挥发性香气成分总量对比SBSE仍较少；SDE方法虽操作简单，仅需少量样品，但提取过程中的高温环境易导致茶叶香气物质发生氧化、降解等化学反应，继而造成了茶香与实际不符[35]。

SBSE技术与常见的其他茶叶香气萃取技术相比，具有不使用有机溶剂、所需样品量少（本实验中仅需600 mg）、萃取量大、简单易操作、茶叶香气成分还原度高、回收率及重复性较好等特点，因此在西湖龙井茶香气成分萃取上具有一定的优势。但值得注意的是，从西湖龙井香气成分分析结果看，SBSE方法目前仍存在一些技术缺陷：首先，SBSE方法可以大量萃取到茶汤中的挥发性组分，但由于挥发性香气成分的沸点存在差异，因此存在一部分低沸点挥发性香气成分萃取初期大量逸出茶汤，无法较好地被搅拌棒吸附；其次，本实验使用的搅拌棒萃取涂层为单一PDMS，该涂层针对非极性及极性较弱的非挥发性成分富集能力较强，然而该涂层无法较好地富集极性成分；最后，由于本实验中搅拌棒处于浸没于茶汤中状态，这使得茶汤当中一部分极性较小的非挥发性成分也在一定程度上被萃取涂层吸附，因此本实验条件下的香气分析结果相对于纯挥发性成分较为复杂，后期数据处理时需要更进一步对分析组分进行判别鉴定；鉴于此，在后续研究中考虑改进SBSE萃取方法，如同时使用PDMS及EG-Silicone 2 种搅拌棒进行香气成分萃取，从而使富集成分极性范围更广；采用SBSE结合吹扫捕集方法，从而实现对顶空及茶汤中香气成分的同时萃取；SBSE搅拌棒顶空处理实现对茶汤上方挥发性成分的富集等。此外，对比GC-MS技术，全二维气相色谱-飞行时间质谱技术其分析方法的灵敏度更高、峰容量更大、检测得到的成分更多[36]，因此，本实验在后续的西湖龙井香气研究中，将尽可能把SBSE方法与全二维气相色谱-飞行时间质谱结合，并综合气相色谱在线嗅闻技术与香气活度值分析方法，对西湖龙井茶的香气成分进行系统全面的分析研究。

3 结 论

本实验采用SBSE前处理方法萃取西湖龙井茶的香气成分，并结合GC-MS进行香气分析；通过优化搅拌棒类型、茶水比、萃取时间、萃取温度、搅拌棒转速、NaCl溶液质量分数等萃取参数，确定了适用于西湖龙井茶的SBSE最优萃取条件：PDMS涂层搅拌棒，600 mg茶粉，10 mL 80 ℃热水冲泡，质量分数5% NaCl溶液，1 250 r/min条件下搅拌萃取90 min，而后进行GC-MS分析。经SBSE-GC-MS分析，从西湖龙井茶中检测出17 类共173 种挥发性成分，主要包括37 种烷烃类、22 种酯类、17 种醇类、16 种酮类、15 种芳香烃、15 种醛类、11 种烯类、9 种烯酯类、5 种内酯类化合物、烯酮类5种、烯醛类4 种、3 种烯醇类、3 种氧杂环类、3 种氮杂环类、3 种含硫化合物、3 种有机酸类化合物以及2 种醚类化合物；正己醛、苯甲醛、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、芳樟醇及其氧化物、香叶醇、吲哚、反-β-紫罗兰酮具有较高的相对含量；对比其他香气萃取方法，SBSE具有萃取量大、操作更简易、茶叶香气成分还原度高、回收率及重复性较好等特点，在西湖龙井茶香气成分萃取上具有明显的优势，有望成为今后茶叶挥发性成分分析的重要研究方法之一。