基于响应面法优化白鲜皮SFE工艺及抗氧化活性研究*

倪鹏辉，刘春峰，谢 玲，王晓丽，郭丽娜*，王伟明*

（1.黑龙江省中医药科学院 中药研究所，黑龙江 哈尔滨150036；2.齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔市康盛中药材饮片加工厂，黑龙江 齐齐哈尔161006；4.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔161006）

白鲜皮为芸香科植物白鲜（Dictamnus dasycarpus Turcz）的干燥根皮，有羊膻气。味苦，性寒，归脾、胃、膀胱经。具有清热燥湿，祛风解毒之功效，用于湿热疮毒，黄水淋漓，湿疹，风疹，疥癣疮癞，风湿热痹，黄疸赤尿等症。国内外学者对其化学成分和药理活性进行了研究。发现白鲜皮含有挥发油、生物碱类、柠檬苦素类和多糖等多种化合物，具有抗肿瘤、止血、抗氧化、抗炎及杀虫等药理活性。经文献检索未见采用超临界流体萃取技术（SFE）提取白鲜皮抗氧化活性成分的报道，因此，设计并进行了以下实验研究。

响应面法（RSM）是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。用响应面法优化工艺过程主要涉及3步：实验设计、建立数学模型评估相关性、预测响应值考察模型的准确性。

1 实验部分

1.1 实验设备

Spe-ed SFE-2型超临界流体萃取仪（美国ASI公司）；紫外可见光分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）；AE-240型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；18目型标准检验筛（浙江上虞市华丰五金仪器有限公司）。

1.2 实验原料与试剂

白鲜皮药材购自康盛中药材饮片加工厂（经齐齐哈尔医学院药学院郭丽娜教授鉴定为白鲜科植物白鲜的根皮）；1.1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH；东京化成工业株式会社）；L（+）-抗血酸（VC天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯、甲醇（AR天津市富宇精细化工有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 超临界流体萃取 将白鲜皮药材粉碎，过18目筛，称取约15g，装入萃取釜，将萃取釜连接到超临界流体萃取装置，设置萃取压力、萃取温度、萃取时间等实验条件，进行提取。萃取结束，收集白鲜皮SFE萃取物，计算得率。计算公式：提取率%=萃取物量/白鲜皮药材量×100%。

1.3.2 响应面法优化萃取条件 首先，针对影响超临界流体萃取较大的影响因素做单因素考察，并确定响应面实验的水平区间。利用Design-Expert.V8.0.6软件根据中心组合设计（Central Composite Design,CCD）原理，针对实验影响因素，以提取率为响应值进行响应面实验设计。按照设计结果进行实验得到各组实验条件对应的提取率。利用Design-Expert.V8.0.6软件分析实验结果，优化实验条件。

1.3.3 DPPH法测定萃取物清除自由基能力 取约100mg超临界流体提取的白鲜皮萃取物样品，溶于2mL乙酸乙酯，分别在2mL的DPPH甲醇溶液中加入 0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05mL 的样品溶液，补加乙酸乙酯至3mL。形成8个溶度梯度，分别为 6.73、5.89、5.05、4.21、3.37、2.53、1.68、0.84mg·mL-1。空白对照组加入1mL乙酸乙酯。样品与DPPH反应30min，用紫外分光光度计测517nm处的吸光度值。以抗坏血酸为阳性对照，按同样方法测DPPH自由基清除率。样品组吸光度值为Ax、空白对照组吸光度值为A0。自由基清除率计算公式：清除率%=（A0-Ax）/A0×100%。利用SPSS Statistics软件进行抗氧化活性IC50值计算。

1.3.4 数据分析 利用Design-Expert.V8.0.6软件进行响应面实验设计，数据分析。利用SPSS Statistics软件进行抗氧化活性IC50值计算。

2 结果与讨论

2.1 单因素影响试验

2.1.1 萃取压力 萃取温度固定在50℃，萃取时间固定在30min，考察不同萃取压力提取率的影响，结果见图1。

从图1可以看出，随着提取压力的增加，3.00×107Pa压力前提取率迅速上升，后增加压力提取率呈缓慢下降趋势。为减少能耗，选择萃取压力范围为2.00×107～4.00×107Pa。2.1.2 萃取温度 萃取压力固定在3.00×107Pa，萃取时间固定在30min，考察萃取温度对白鲜皮提取率的影响，结果见图2。

图2 萃取温度对白鲜皮萃取物提取率的影响Fig.2 Influence of extraction temperature on the extraction rate of Cortex Dictamni

从图2可以看出，随着提取温度的上升，60℃前提取率迅速上升，后温度增加提取率不再增加。固选择萃取温度范围为50～70℃。

2.1.3 萃取时间 萃取压力固定在3.00×107Pa，萃取温度固定在60℃，考察萃取时间对白鲜皮提取率的影响，结果见图3。

图3 萃取时间对白鲜皮萃取物提取率的影响Fig.3 Influence of extraction time on the extraction rate of Cortex Dictamni

从图3可以看出，随着提取时间的增加，30min前提取率上升，后睡着时间加长提取率略有降低。固选择萃取时间范围为20～40min。

2.2 采用RSM优化白鲜皮SFE工艺

2.2.1 响应面分析因素水平设计与方案设计及结果 根据CCD原理，在上述单因素影响实验结果的基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面设计的因素与水平Tab.1 Factors and levels in the response surface design

利用Design-Expert.V8.0.6软件设计响应面实验方案，共20个点，其中14个为析因点，6个为零点，以白鲜皮萃取物性成分的提取率为响应值（y），设计方案与实验结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果Tab.2 Response surface designexperiments and results

2.2.2 实验数据分析 利用软件Design-Expert.V8.0.6进行多元回归拟合、方差分析和显著性检验，得到以白鲜皮提取率为目标的函数，关于各影响因素的二次回归方程为：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。式中，萃取压力、萃取温度、萃取时间分别对应A、B、C。方程中各项系数的绝对值大小直接反应了各项萃取因素对响应值的影响程度大小，系数的正负反映了影响的方向。由回归方程可知，萃取压力和萃取温度的线性项及萃取压力的二次项对提取率的影响较为显著。

对响应值进行方差分析，结果见表3。

表3 响应值方差分析表Tab.3 Variance analysis of response value

由表3可知，模型p值为0.0003，远小于0.01，说明该模型极其显著；其中R2=91.67%，表明91.67%的实验数据可用该模型解释，说明方程的可靠性。模型RSD值显示实验操作的稳定性，RSD值越低，显示实验稳定性越好，本实验RSD=8.12%，较低，说明实验操作稳定性较好。该模型拟合度好，实验误差较小，可以此模型分析预测CO2超临界流体萃取白鲜皮的工艺结果。由方程各项系数及表中对各项系数的显著性分析显示，A、B极显著，C不显著；交互项不显著；二次项A2、B2极显著，C2不显著。表明萃取压力和萃取温度对超临界流体萃取白鲜皮具有很大影响，萃取时间影响较小。影响程度依次为萃取压力＞萃取温度＞萃取时间。

2.2.3 白鲜皮SFE工艺响应面分析

图4～6通过响应面的走势及坡度，体现出各实验参数对响应值的影响程度。在这组图中，萃取压力和萃取温度侧曲线变化陡峭，萃取时间侧相对平缓，说明压力和温度较时间因素对响应值影响明显。

图4 萃取压力和温度对提取率的影响Fig.4 Extraction pressure and temperature on the extraction yield

图5 萃取压力和时间对提取率的影响Fig.5 Extraction pressure and time on the extraction yield

图6 萃取温度和时间对提取率的影响Fig.6 Extraction temperature and time on the extraction yield

图4中响应面走势陡峭，等高线密集，表明萃取压力和萃取温度相互作用较显著。图5较图4响应面走势较平缓，等高线较稀疏，表明萃取压力和萃取时间相互作用较弱。图6响应面走势平缓、等高线稀疏，表明萃取温度和萃取时间相互作用不明显。

通过软件分析得到最佳萃取条件为压力3.71×107Pa，温度 67.2222℃，时间 31.8148min，最大提取率为1.51%，根据实际操作修正后得到的最佳条件为 3.71×107Pa，67℃，32min。白鲜皮萃取物提取率理论值可达到1.51%。为验证响应面优化所得结果，按上述萃取条件平行试验3次，平均提取率为1.50%，与预测值相比误差较小。

2.3 DPPH法[5]测定白鲜皮萃取物清除自由基活性

表4 不同浓度白鲜皮萃取物及VC与对应DPPH清除率Tab.4 Extraction,VC with different concentrations and Scavenging rate on DPPH

图7 不同浓度白鲜皮萃取物对DPPH的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of extraction with different concentrations on DPPH

图8 不同浓度VC对DPPH的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of VC with different concentrations on DPPH

由表4和图7、8可知，白鲜皮萃取物具有一定的清除DPPH自由基能力，且随浓度的增加而增强。利用SPSS Statistics软件计算得白鲜皮萃取物样品DPPH 清除率的 IC50=3.79mg·mL-1，VC的 DPPH 清除率的 IC50=0.04mg·mL-1。

3 结论

（1）采用响应面试验设计方法得到白鲜皮萃取物CO2超临界流体提取工艺参数的二次回归方程：y=1.39+0.18×A+0.14B+0.048C-0.0062AB+0.036AC-0.049BC-0.13A2-0.083B2+0.053C2。该方程能较好的预测超临界流体萃取白鲜皮的提取率随各参数变化的规律。

（2）利用软件进行数据分析并根据实际操作修正后得到最优实验条件为：萃取压力3.71×107Pa，萃取温度67℃，萃取时间32min。以此条件进行3次平行试验，得到白鲜皮平均提取率为1.50%。

（3）本研究还测试了用超临界流体萃取的白鲜皮萃取物清除自由基的能力。白鲜皮萃取物对DPPH自由基有一定的的清除能力且有浓度依赖性，IC50=3.79mg·mL-1。与阳性对照品 VC 的 IC50=0.04mg·mL-1相比差很多。