miR-144在前列腺癌细胞中的表达对肿瘤增殖和迁移的影响
2020-03-11
前列腺癌(PCa)是男性中 诊断率居第二位的癌症,也是全世界第五大最常见的男性死亡原因。近年来,虽然对前列腺癌诊断和治疗的研究取得了很大进展,但前列腺癌的发病率和死亡率仍然很高[1]。前列腺癌生存率低的主要原因之一是其机制尚不清楚,缺乏有效的治疗。因此,有必要揭示前列腺癌的分子机制,寻找治疗前列腺癌的潜在靶点。
miRNAs是一类高度保守的非编码小RNA分子,不仅参与细胞的增殖、凋亡、分化、信号转导和代谢,而且参与肿瘤细胞的转化[2,3]。它在各种疾病的发生和发展中也起着至关重要的作用。此外,miRNAs的异常是由于基因丢失和突变、表观基因过度表达或沉默以及肿瘤转录因子活性异常所致[4]。大量研究表明,miRNAs在胃癌[5]、膀胱癌[6]、乳腺癌[7]和骨肉瘤[8]等多种恶性肿瘤中具有癌基因或抑癌基因的作用。然而,大多数miRNAs在前列腺癌中的表达和功能尚不清楚。
最近有研究证明,miR-144-3p在胰腺癌[9]、胶质母细胞瘤[10]、胃癌[11]等癌症中起着抑癌作用。然而,该基因在PCa中的表达和作用尚未明确。富含脯氨酸的蛋白质11(PRR11)位于染色体17q22上,编码360-氨基酸蛋白质。生物信息学分析表明PRR11含有2个富含脯氨酸的区域和1个锌指结构域[12]。通过靶基因预测软件miRanda、Target Scan 6.2显示,miR-144与PRR11有着密不可分的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和抗体 细胞LNCaP细胞株购自东南大学附属中大医院泌尿外科研究所。培养于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,胎牛血清、1640 培养基、0.2 5%胰蛋白酶购于美国Gibco公司,细胞计数试剂盒(CCK-8)、结晶紫染色液、BCA 蛋白浓度检测试剂盒购于中国碧云天生物技术研究所,PRR11抗体、β-actin抗体、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、反转录试剂盒及实时定量聚合酶链凡益试剂盒购自美国 Promega 公司,miR-144模拟物(miR-144 mimics)和阴性对照(miR-NC)购自上海吉玛公司。
1.2 实时定量反转录聚合酶链(RT-qPCR)法 用Trizol试剂从培养细胞中提取总RNA,并检验其纯度和浓度按照反转录反应说明书操作,以U6作为内参,根据试剂说明书设定反应条件进行实验,所有计算值均采用2-ΔΔCT表达mRNA相对表达量。
1.3 细胞转染与分组 在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中,用含有10%胎牛血清1640培养基培养人前 列腺癌LNCaP细胞株。取生长良好,融合60%~80%的细胞,按Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别将miR-144和miR-NC转染到 LNCaP细胞,转染后进行后续实验。
1.4 CCK-8法检测LNCaP细胞增殖能力 选择状态良好、处于对数生长期的细胞,分别转染miR-144和miR-NC 后进行实验。转染48h后,将2 000个细胞/孔接种于96孔板中,分为24、48、72、96h组,每组分别设置5个复孔,每孔分别加入10μl CCK-8试剂,继续在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育1h,用酶标仪检测每孔的OD 值,吸收波长450nm。
1.5 Transwell实验 选取转染后生长良好的细胞,在24孔板中加入600μl完全培养基,取100μl无血清含2×104细胞悬液种植于Transwell小室的上室,每组3个复孔。将上室置于下室中,将小室放在细胞培养箱中培养8~14h后取出上室,用95%甲醇固定细胞15min后风干小室,再用0.2%结晶紫染色20min,每个小室随机取5个200倍镜视野。
1.6 Western blot实验 将转染过48h的细胞,用细胞及裂解液裂解细胞并提取蛋白,测定蛋白后继续实验。每个样品中的蛋白质70V电压SDSPAGE凝胶电泳30min,然后调节为110V继续电泳80min,切胶,以200mA转膜2h。用5%脱脂牛奶在Tris-HCl缓冲液中封闭,并在一抗孵育过夜。在TBST中洗涤3次后,在二抗中孵育2h。用ECL法显示条带。
1.7 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理,所有数值以均数±标准差(±s)表示,两组之间比较采用t检验,当P<0.05时认为差异有统计学意义,所有的数据来自3次独立重复实验。
2 结果
2.1 两组转染后LNCaP中miR-144相对表达量比较 分别提取转染过miR-NC和转染过miR-144细胞RNA,逆转录成cDNA进行荧光定量PCR实验。miR-144组表达量明显高于miR-NC组(1494±94.63 vs 0.8733±0.1157,P<0.0001),见图1A。
2.2 两组抑制前列腺癌细胞株LNCaP增殖能力比较 与转染miR-NC组相比,转染miR-1 44组明显抑制前列腺癌LNCaP细胞株增殖能力(P<0.01)。见图1B。
2.3 两组抑制前列腺癌细胞株LNCaP迁移能力比较 过表达miR-144之后LNCaP细胞体外迁移能力与转染miR-NC细胞相比显著降低(143.0±6.351 vs 196.0±16.20,P=0.0382),见图1C。
2.4 miR-144调控前列腺癌LNCaP细胞株中PRR11的表达 采用靶基因预测软件miRanda、Target Scan 6.2等,结合文献,预测PRR11是miR-144的潜在下游靶基因:PRR11 3'UTR-WT:5'-GUAUGGAGCC CACACAUACUGUG-3';miR-144-3P:3'-UCAUGUA GUAGAUAUGACAU-5';PRR11 3'UTR-MUT:5'-GUAUGGAGCCCACACAGCAACUG-3'。在前列腺癌细胞株LNCaP细胞中转染miR-144 mimics及miR-NC后,根据实验方法中的操作步骤,分别提取两组细胞的蛋白,测定蛋白浓度后进行Western blot实验。实验结果证明过表达miR-144后,LNCaP细胞中PRR11的表达量显著下降(P=0.030),miR-144与PRR11呈负向调控关系。见图2。
图1 miR-144体外抑制前列腺癌细胞LNCaP增殖和迁移
图2 miR-144抑制前列腺癌细胞株LNCaP中PRR11相对表达量
3 讨论
前列腺癌的发病率在美国已经超过肺癌,成为首位危害男性健康的肿瘤,占男性肿瘤发病率的28%。据美国癌症协会的估计,2011年美国有240 890新发病例,有33 720人死于前列腺癌[13]。miRNAs在多种肿瘤细胞中起关键作用,包括肿瘤生长、凋亡和肿瘤细胞转移,可作为癌基因或抑癌基因[14,15]。此外,应用不同miRNAs在血浆、血清和肿瘤标本中的表达谱对人类癌症进行了准确分类,提示miRNAs可能是诊断人类癌症和患者预后的生物标志物[16]。这些结果都证明miRNAs对肿瘤的发生有着重要作用,迫切需要我们揭示miRNAs在前列腺癌进展过程中的作用机制。有研究表明,很多miRNAs可参与前列腺癌进展过程。Guan等[17]报道,miR-218在前列腺癌组织和细胞株中的表达下调,并且通过直接靶基因Gli1抑制前列腺癌细胞的迁移、上皮间充质转换。Hu等[3]发现miR-212通过调控MAPK1抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭。同时,Mushtaq等[11]报道,miR-144通过下调AP4抑制胃癌细胞增殖和侵袭。
据报道,PRR11在癌症发展中起重要作用,Zhou等[12]研究表明在ESCC细胞株中PRR11的mRNA和蛋白水平显著高于NEECs,同时过表达的PRR11促进食管鳞状细胞癌的成瘤能力,并与食管鳞状细胞癌的进展有关。另外,Qiao等[18]研究结果说明敲除PRR11可以 通过β-catenin信号通路抑制肝细胞癌生长和上皮间充质转化。
本研究结果显示,miR-144通过下调PRR11抑制前列腺癌细胞株LNCaP增殖、迁移。说明miR-144在前列腺癌发展过程中发挥着重要的抑制作用,此作用可能与PRR11的表达有着密不可分的关系。