病毒诱导的基因沉默技术在双子叶植物中的应用研究进展

张琴琴，纪兆林，朱 峰

(扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是近20 a发展起来的能够快速鉴定基因功能的反向遗传学重要方法之一，是发生在RNA水平转录后的基因沉默现象[1-2]。VIGS最早被用来描述植物受病毒侵染后症状的恢复情况，当植物被病毒侵染时，携带目的基因的病毒载体会使植物的表达水平下降，从而确定基因在植物中的功能[3]。随着后基因组时代的到来，众多植物已先后完成全基因组测序工作。为确定基因的功能，需要进行进一步的鉴定。VIGS技术具有成本低、试验周期短、效率高、方法操作简单、获得表型快以及高通量等优点[4]，被广泛应用于植物基因功能研究中。双子叶植物在自然界约有200 000个物种，分布广泛，具有重要的经济价值。VIGS技术已经在双子叶植物中广泛应用，然而还未见VIGS在双子叶植物中应用的综述。鉴于此，阐述VIGS技术的作用机制，综述VIGS技术在茄科、豆科、蔷薇科、葫芦科、锦葵科和菊科等双子叶植物中的应用及存在的问题，并对前景进行展望。

观察组患者治疗完成之后从饮食、用药及血糖自我检测方面的依从性高于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

1 VIGS技术的作用机制

转录后基因沉默可抑制植物受病毒的侵染，是植物中天然存在的免疫系统[5-6]。基因沉默现象主要在稳定生物基因组、识别和抑制外源基因表达，以及防止病毒和转座子入侵方面具有重要作用[7]。在进化过程中，植物进化出许多防御病毒入侵的机制，VIGS是其中的一种。利用病毒载体携带目的基因cDNA片段，在病毒复制和转录过程中，诱导序列同源基因mRNA的降解或甲基化，来实现对基因功能的鉴定。在RNA聚合酶作用下病毒载体携带目的基因cDNA片段形成双链RNA，这种双链RNA作为复制中间体，是沉默过程中关键的激发子，其被切割成21～24个核苷酸小分子干扰RNA，切割物是RNaseⅢ家族特异性核酸内切酶Dicer的类似物[8]。在植物中，RNA聚合酶扩增小分子干扰RNA，以单链形式和一些蛋白质结合形成RNA诱导复合物，在小分子干扰RNA指导下，诱导复合物与病毒mRNA互补配对，以序列特异性方式对目的基因进行剪切[7]，从而使靶基因mRNA发生特异性降解，导致目的基因在RNA水平上沉默[9-14]。

2 VIGS技术在双子叶植物中的应用

双子叶植物约有200 000个物种，在世界范围内广泛分布，双子叶植物有木兰科、十字花科、葫芦科、山茶科、锦葵科、蔷薇科、豆科、菊科、茄科、旋花科等。选择合适的VIGS载体对研究植物基因功能具有重要作用，已有大量VIGS载体应用于双子叶植物，如表1所示。

表1 VIGS载体在双子叶植物中的应用Tab.1 Application of VIGS in dicotyledons

续表1 VIGS载体在双子叶植物中的应用Tab.1(Continued) Application of VIGS in dicotyledons

2.1 VIGS技术在茄科植物中的应用

茄科植物是重要的经济与药用植物，伴随茄科植物基因组测序的完成，需要对众多基因功能进行鉴定，VIGS技术已广泛应用于茄科植物，如用于研究茄科植物生长发育相关基因的功能、鉴定茄科植物代谢产物生物合成途径调控基因的功能、解析茄科植物防御真菌病害信号传导路径中抗性相关基因的功能[36]等。由于VIGS发生在RNA转录后，不需要遗传转化，并且可以在植物中观察和测量出目的基因沉默后的生理生化指标，因此可以方便快捷地鉴定植物生长发育相关调控基因的功能。目前，TRV载体已广泛应用于茄科植物[37]。通过研究TRV载体的VIGS体系，实现对番茄和本生烟MSH1基因的沉默，证明MSH1基因可以调控植物发育。另外，VIGS技术已经应用于研究茄科植物代谢调控相关基因的功能，解析了茄科植物光合过程中生物碱生物合成、酚类次生代谢物生物合成、萜烯类化合物代谢调控，以及必需色素合成代谢途径中多种关键基因的功能。

近年来，栽培大豆的基因组测序工作已完成，构建了野生大豆泛基因组，并不断地完善大豆种质资源的测序数据[45]。在大豆研究过程中，筛选优良性状基因、对基因功能进行验证已经成为研究热点。近十几年来，已有诸如黄瓜花叶病毒(CMV)、豆荚斑驳病毒(BPMV)和苹果潜隐球状病毒(ALSV)等多种VIGS病毒载体成功应用于豆科植物基因功能的研究中(表1)。在对豌豆枯叶病毒(PWV)进行探索的过程中，为沉默PDS基因，将携带PDS基因的cDNA片段插入到病毒载体的单链RNA2中，之后侵染豌豆[46]。VIGS技术应用于豆科植物，既不会影响豆科植物与根瘤菌共生形成根瘤，也不会对豌豆开花及结荚成熟产生影响[47]。利用RNA病毒载体可对系统免疫相关基因以及抗性相关基因功能进行鉴定。例如，COOPER等[48]利用豆荚斑驳病毒(BPMV)系统沉默Rpp1，导致大豆丧失对根腐病的免疫功能，表明Rpp1基因调控的根腐病免疫途径以及相关基因与大豆防御系统紧密相关。此外，代谢途径中相关的功能基因也可以通过VIGS技术进行鉴定，例如，利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建CHS(编码查尔酮合成酶)-VIGS病毒系统，沉默查尔酮合成酶基因，使大豆种皮由棕变黄[49]。将VIGS技术应用于豆科植物不同发育时期不同组织，也可使用RNA病毒。例如，在不同时间和空间对豆荚斑驳病毒(BPMV)建立基因沉默体系，试验中花、茎、叶和根均沉默了GFP基因，但沉默效果在不同组织中表现不同，花和叶中沉默效果最强，几乎全部沉默，茎沉默效果次于花和叶，根沉默效果最弱。试验结果对反向遗传学在不同组织中的研究具有参考价值[50]。

2.2 VIGS技术在豆科植物中的应用

随着VIGS技术的发展，其已有效运用于鉴定茄科植物非生物胁迫与应答生物信号调控网络中关键基因的功能，研究与植物-细菌互作、植物-真菌互作、抗病毒、抗植食性害虫、抗线虫以及耐热、抗旱等相关的基因。另外，VIGS技术在抗病毒病方面也有相关应用，如通过将病毒基因片段导入植物，沉默该基因，使植物对这种病毒或有亲缘关系的其他病毒产生抗性。除此之外，VIGS技术也在番茄抗叶霉病、抗白粉病、果实成熟调控以及果实抗冻中有应用[38]。VIGS技术用于研究番茄叶霉病时，构建TRV载体沉默NRC1基因(NB-LRR protein required for HR associated cell death 1)，从而抑制Cf-4和Avr4的相互作用，表明NRC1基因在抗番茄叶霉病基因介导的抗病反应中发挥重要作用[39]。此外，运用该技术沉默ACRE276基因，证明在抗叶霉菌过程中，该基因是一种必需基因[40]。通过TRV-VIGS技术对功能基因组学进行研究，筛选并鉴定病害中的防卫反应基因，沉默具有高抗白粉病的番茄植株S.habrochaitesG1.1560(含抗病基因Ol-1)，找到了ShGSTU1(编码谷胱甘肽转移酶)、ShME1(编码NADP苹果酸酶)、ShMADSTF(编码MADS盒转录因子)、ShORR-1(功能未知新基因)4个和白粉病相关的基因[41]。此外，通过VIGS技术，已经研究出在番茄果实成熟过程乙烯合成途径中关键调控因子的功能。例如，番茄ACC氧化酶(LeACO1)在乙烯合成途径中起重要作用，表达下调抑制番茄果实成熟[42]。另外，番茄F-box基因SlEBF作为乙烯信号途径中的负调控子，通过构建TRV-VIGS体系在番茄中同时沉默基因SlEBF和SlEBF2，沉默植株出现生长缓慢、衰老加快、果实早熟等现象[43]。牛义岭等[44]在以SIGLD1基因构建pTRV2-SIGLD1载体时发现，SIGLD1和番茄耐低温相关，对番茄抗冻研究具有重要意义。可见，VIGS已在常见的茄科植物基因功能研究中广泛应用。

物流联盟为整合行业资源的有效措施。在跨境物流中，存在着诸多问题，如：运送环节多而繁琐、时间长、投资大等，加之跨境物流运送频率很高但批量较小，很难形成规模效用，目前为止，在我国除了邮政跨境物流以外，单个的民营物流企业的资本是薄弱的，网点覆盖范围小，规模小，从跨境物流中获取更多的利润是十分困难的。 因此，快递企业在运行过程中，尤其是要发展跨境物流，首先要有资金基础，如果资金有限，通过几个行业合作，对行业资源进行整合，减少竞争，共同从跨境物流中获得利润。通过这样的方式，一方面可以扩大物流规模，拓宽物流网点覆盖的范围，还可使单个企业跨境物流的成本大大降低，这样的方式是十分可行的。

2.3 VIGS技术在蔷薇科植物中的应用

蔷薇科植物有桃、草莓、苹果等，具有较高的经济价值，在世界范围内分布广泛。据研究，花色苷合成过程中第1个酶是查尔酮合成酶，这种酶在影响桃果皮色泽形成过程中具有重要作用。通过TRV载体介导的VIGS技术研究CHS沉默对桃果实花色苷代谢的影响[51-52]。结果显示，抑制CHS基因降低了桃果皮中槲皮素糖苷和花青素糖苷的含量，可将花色苷代谢途径向绿原酸及其复合物方向转换。证实CHS是能够控制类黄酮代谢方向的物质，并在花色苷代谢途径中发挥重要作用[51-52]。另外，研究者利用TRV介导的VIGS技术，以GFP和PDS为标记基因，在草莓中构建VIGS体系，研究VIGS技术是否可以应用于草莓[53]。研究发现，利用紫外灯和荧光显微镜可以筛选出GFP沉默的植株，沉默植株的果实和叶片出现光漂白现象，PDS在沉默植株中的表达量明显下降，表明TRV介导的VIGS体系在草莓中成功构建。此外，研究者通过构建TRV-VIGS载体研究澳洲青苹，沉默转录因子MdHB-1基因，分析其对果实乙烯合成过程中关键基因MdACO1的表达及果实成熟相关指标的影响[54]。结果表明，抑制MdHB-1基因可以降低MdACO1的表达量，延缓果实成熟衰老[54]。

葫芦科植物有西葫芦、葫芦、丝瓜、香瓜、西瓜和黄瓜等，在蔬菜和水果中占有重要地位。ALSV是首次报道可用于葫芦科作物构建VIGS的病毒载体[55]。将克隆后的黄瓜叶片八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因和SU基因(300 bp)重组到ALSV-RNA2中介于MP和Vp25，构建ALSV-PDS和ALSV-SU2个载体，将载体导入西葫芦、葫芦、丝瓜、香瓜、西瓜和黄瓜等葫芦科植物的子叶。结果表明，导入ALSV-PDS的葫芦科作物均具有光漂白表型，其表型与敲除PDS基因相似，说明导入ALSV-PDS载体的植物内源PDS基因已被沉默。并且在葫芦科作物中导入ALSV-SU载体，均会出现黄叶表型，其与SU基因被抑制的表型状况相一致，说明导入ALSV-SU载体可使SU基因沉默[56]。

2.4 VIGS技术在葫芦科植物中的应用

因此，加强高校思想政治教育，既是因应新的发展形势的现实需要，也是迎接教育事业、中国特色社会主义事业新的发展机遇的必然要求。为早日实现现代化培育一批又一批思想素质硬、本领强、有理想、有信念、有担当的高素质人才，亦是新时代高校加强思想政治教育的根本目的所在。

2.5 VIGS技术在锦葵科植物中的应用

锦葵科植物以富含纤维著称，具有重要经济价值。近年来，在棉花基因功能研究方面VIGS技术已广泛应用。利用VIGS技术可发掘棉花中特异性基因，如与抗逆或品质相关的功能基因。例如GhCPK基因与黄萎病抗病有关[57]，通过构建TRV-VIGS体系，将棉花中GhCPK基因沉默后，发现基因沉默的棉花对黄萎病更加敏感，发病指数更高，表明GhCPK基因可能与棉花黄萎病信号调控途径有关。穆春等[58]利用pTRV-GhCTR1沉默载体侵染棉花，发现侵染植株的GhCTR1基因表达水平显著降低，表明VIGS技术可用于研究棉花基因功能。

2.6 VIGS技术在菊科植物中的应用

菊花是重要的园艺观赏花卉，花瓣的生长对花卉的品质有重要作用，因此对与花瓣生长相关的基因进行研究十分必要。利用金黄色非洲菊品种深圳5号(S5)的舌状花花瓣，以葡糖苷酸酶基因GUS为基础，建立非洲菊花瓣瞬时表达系统。利用花色素苷合成途径中关键转录因子GMYB10基因，以pTRV2为表达载体，将GMYB10连接到载体上，建立非洲菊花瓣的VIGS系统[59]，该系统对研究非洲菊花瓣分子发育机制及相关植物具有重要作用。在菊科植物中，报告基因对植物花瓣颜色有影响，选择正确报告基因可有效衡量沉默效果[60]。选择GMYB10作为报告基因，在非洲菊花瓣构建pTRV2-GMYB10载体，利用GMYB10基因编码的MYB类转录因子，促进下游结构基因表达，从而合成花色素苷，进而对花色形成有作用[61-62]。

3 VIGS技术应用于双子叶植物存在的问题和前景展望

VIGS技术与传统鉴定基因的方法相比，具有试验周期短、方法操作简单、成本低、效率高、获得表型快以及高通量等优点，被广泛应用于研究植物的生长发育、抗病抗逆、代谢调控等生理过程。然而随着研究的不断深入，VIGS技术在应用过程中也存在一定的局限性，例如VIGS技术存在功能敲除不彻底、基因沉默脱靶、持续时间有限、沉默不均一等问题。基因沉默不彻底是VIGS技术的最大问题，对于只需积累极少量转录本就可获得足够蛋白质的基因来说，利用VIGS技术难以对其功能进行鉴定。基因沉默不均一，即基因在植株某些部位沉默效率高，某些部位沉默效率低。基因沉默水平在不同植株间也表现出不同效应，有些沉默植株只在局部产生表型，而基因沉默后不产生明显表型[63]。VIGS技术引起的沉默持续时间有限，一般有效沉默期约30 d，之后将出现基因沉默衰减和表型恢复等现象，对于生长周期较长的植物，30 d的沉默期明显不够[64]。另外，VIGS技术会导致沉默脱靶，利用相关软件及核酸数据库寻找特异序列，可避免脱靶效应，提高目的基因沉默准确度。在植物体内积累一定量的dsRNA是基因沉默所必须的，当处理一些小量表达基因时，VIGS技术会导致小量表达的基因沉默效果不佳[65]。另外，同时存在相同或相似基因序列时，会同时受到VIGS的干扰，此时将不能明确引起沉默现象具体基因。利用VIGS技术对幼苗或植物局部转导的基因不具有遗传性，不能用于研究种子发芽和幼苗早期生长。有效沉默目的基因、优化VIGS体系、提高载体利用效率等，仍是VIGS技术所面临的亟需解决的问题。通过不断改良与优化VIGS技术在一定程度上可以解决以上问题，如为了提高载体的沉默效率，利用“Fruit-VIGS”、Gateway、人工miRNA等载体增加VIGS技术的应用范畴[66-70]。通过不断发展分子生物学以及不断深入解析基因沉默机制，最终可弥补一些VIGS技术方面的不足。例如基因表型不稳定和基因沉默效率低等问题，可通过建立更加高效准确的VIGS技术体系解决。随着 VIGS 机制的深入解析以及分子生物学技术的进一步发展，相信未来一定能够克服VIGS技术存在的缺陷和不足，建立更为精准和高效的VIGS体系，使其在植物功能基因研究中得到更广泛的应用。