植物细胞分裂素氧化酶基因研究进展①

马铭赛,欧阳乐军,李莉梅,王泽琛,肖荣,布梁灏,刘智超

(1.广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东 茂名 525000；2.喀什大学 生命与地理科学学院/叶尔羌绿洲生态与生物资源研究高校重点实验室，新疆 喀什 844000)

细胞分裂素(CK)是一类重要的植物激素，它们在调控植物生长发育及其逆境响应过程中发挥着决定性作用，具有促进细胞分裂，平衡主根与侧根的生长，调节植物各个器官的发育等多种生理功能。细胞分裂素氧化酶(CKX)既能特异性催化细胞分裂素类异戊二烯侧链的不饱和键，又能控制CK的合成与降解，稳定植物体内CK的含量，是目前发现的唯一可促进内源CK降解的关键酶。

目前，关于植物CKX的研究主要集中在其结构、性质、作用机理等方面，而关于其功能的研究报道较少。为研究CKX的功能，可通过克隆植物CKX基因、构建植物表达载体，对植物进行转化，观察其在植物生长发育以及响应逆境胁迫中的作用，进而确定CKX的功能。现阶段，利用此方法研究CKX基因的功能已初见成效[1-3]。本文主要对植物CKX基因的表达调控进行综述，提出可利用生物信息学方法预测CKX基因在植物生命活动中的作用机制。

1 CKX研究概述

1.1 CKX研究现状

1971年Paces[4]首次在烟草髓组织培养物粗匀浆中检测到CKX，同时发现粗匀浆可将标记的异戊烯基腺苷转变为腺嘌呤。此后，研究者相继在玉米、小麦、菜豆和蚕豆[5，6]等不同植物的不同组织中检测到CKX。随着研究的不断深入，发现CKX在植物中普遍以糖基化和非糖基化的形式存在[7]。CKX合成由CKX基因表达调控。

CKX在大多数植物中通常以家族的形式存在，且多种植物CKX编码基因的完全序列以及表达序列标签已被鉴定。ZmCKX基因家族被鉴定出至少存在5个家庭成员(ZmCKX1—ZmCKX5)且它们均与玉米粒的早期发育有关；拟南芥AtCKX基因家族中已有7个基因被鉴定(AtCKX1—AtCKX7)且其氨基酸序列的相似性为34.3%～65.9%，其中AtCKX7氨基酸序列相似性最低；水稻OsCKX基因家族中已发现11个成员(OsCKX1—OsCKX11)。还有研究者研究了小麦、棉花、兰花等[7-18]植物的CKX基因。此外，在低等生物念珠藻[19]中也发现了CKX基因。表1列举了近年来关于不同植物CKX的研究情况。

表1 不同植物CKX的研究现状统计

1.2 CKX的生理学功能

CKX在植物的生长发育过程中发挥着巨大的作用。已有的研究发现CKX可通过影响植物配子的发育影响其产量。利用花粉专一启动子识别CKX1，并构建表达载体获得转基因玉米，发现转基因玉米中ZmCKX1的过量表达可导致雄性不育且可显著降低花芽细胞分裂素的含量，从而使玉米的产量降低[20]；为了提高水稻的产量，Ashikari等发现OsCKX2表达量的减少可促进花序组织中细胞分裂素的积累，使籽粒数量增加，进而使水稻的产量增加[21]；Zhang等[22]发现TaCKX2-1和TaCKX2-2在小麦幼穗和茎中过量表达时表达量与穗粒数呈正相关，进而影响小麦的产量。

CKX可影响植物的生长发育进程，为植物的抗逆研究奠定了基础。在研究烟草时发现，老叶片中CKX基因的活性低于幼嫩叶片，间接证明CKX可延缓烟草的衰老，使烟草的生长发育进程减慢[23]；测量生长发育期完全不同的两种大豆的细胞分裂素含量以及CKX的活性，发现生长发育进程快的品种的CK含量较高且CKX的活性较低，生长发育进程慢的则相反，揭示了CKX可延缓大豆的生长发育进程[24]；比较转AtCKX2烟草和野生型烟草，转基因烟草根部和叶部CKX活性增强，细胞分裂素浓度降低，表型改变，生长迟缓，从而证明CKX可改变烟草的生长发育进程[25,26]。Procházková等[27]利用参与细胞分裂素合成的ipt基因转化烟草，发现老叶片中细胞分裂素含量升高，进而延缓了叶片的衰老。

CKX在生物或非生物胁迫下的生长调节方面发挥着一定的作用。把线虫接种于感染线虫的栽培花生和抗线虫的野生型花生之后，发现感染线虫的花生AsCKX表达量增高，抗线虫的花生反之，从而验证AsCKX酶在线虫感染花生时发挥一定的作用[28]。Mytinova等[25,26]发现AtCKX2转基因烟草植株在干旱或盐胁迫下植株抗氧化酶的含量与野生型相比变化明显，说明AtCKX2在非生物胁迫下对植物的生长具有一定的影响。

此外，CKX还可以通过影响植物组织中细胞分裂素的含量来调节植物的生长周期、植物地上与地下部分的生长、棉纤维初始化数目以及豌豆根瘤的形成等[29,30]。

2 CKX研究进展

2.1 CKX在植物中的表达调控研究

CKX参与同种植物的不同组织的调控。在拟南芥中，CKX具有一定的表达特异性，其中，AtCKX1和AtCKX2主要在根尖中表达，AtCKX4集中在托叶、气孔及根冠中表达，AtCKX5在根分生组织中表达效果明显，AtCKX6则主要影响雌蕊的发育[6,23]。在玉米中，CKX的表达在时间和空间方面也存在着一定的差异性，通过研究玉米CKX发现ZmCKX2、ZmCKX3、ZmCKX4、ZmCKX5分别在成熟的雄花穗中、老叶中、未成熟的雄花穗中、未成熟穗中表达；在表达时间上，ZmCKX2仅在授粉完成后才开始表达，ZmCKX3、ZmCKX4、ZmCKX5在授粉前就已经表达，如果ZmCKX5授粉后表达则活性下降[31]。而在草莓中，FvCKX4在幼果的生长过程中发挥着重要的作用，FvCKX5在根中高表达[15]。

植物激素也可影响CKX的表达调控。在大麦叶片中，外施10-4mol/L的细胞分裂素，CKX活性显著提高[23]；赤霉素对拟南芥AtCKX影响很小，但是其合成抑制剂多效唑会使AtCKX3、AtCKX4和AtCKX6转录水平降低，脱落酸会使AtCKX1、AtCKX3、AtCKX4和AtCKX6表达效果下降，茉莉酸、表油菜素内酯等植物激素也会影响拟南芥AtCKX的表达[12]。

2.2 利用基因克隆技术研究植物CKX的功能

植物克隆技术以及转基因技术的出现，对研究植物CKX的功能产生了深远的影响。余义和等[13]将同源克隆和RACE技术相结合，在“巨峰”葡萄中克隆出CKX3，并对其表达特性进行分析，发现CKX3在花序发育过程中表达量差异明显，从而可对花序的生长发育进行调控。在对葡萄叶片用细胞分裂素6-BA 进行处理后，CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性显著升高；随后，薛竟一[14]利用生物信息学知识鉴定得到葡萄的10条CKX序列并克隆其中7个CKX的cDNA全长，经植物生长调节剂处理，获得不同CKX在不同葡萄组织中的表达结果，对研究葡萄CKX的作用奠定了基础；李嘉等将构建成功的植物超表达载体BdCKX1-pCXSN利用农杆菌介导法转化二穗短柄草，得到转基因植株，在T1代转基因植株发现其地上部分生长状况不容乐观，猜测BdCKX1可能参与CK的代谢途径，初步验证了BdCKX1的功能[1]；王玲等运用RACE技术克隆得到狗蔷薇RcCKX5，分析其在狗蔷薇不同组织中的表达情况，并用不同浓度的6-BA处理叶片，由此得到RcCKX5的表达量与6-BA浓度呈正相关，进一步验证了此基因的功能[2]；张超利用生物信息学方法获取桑树MnCKX1—MnCKX6，并对其功能进行预测，采用qRT-PCR技术分析MnCKX1—MnCKX6的时空表达，运用基因编辑技术获得转基因植株并进行分析，研究发现MnCKX3和MnCKX4可能与桑树花器官的发育有关，MnCKX1和MnCKX6可参与调控干旱和盐胁迫，MnCKX2为雄花特异性基因，MnCKX5和MnCKX6可响应外源细胞分裂素，这些可为今后桑树性状的分子改良奠定一定的基础[3]。

吴云华等[32]对水稻OsCKX的重组载体pET-28a-CKO进行构建，为探索水稻OsCKX的功能以及更深层次的研究奠定了基础；张晨等通过克隆得到了太子参的PhCKX，利用ABA和GA3对其进行处理发现，经过ABA处理PhCKX的表达量在生长发育的各个阶段都出现不同程度的降低，而用GA3进行处理则出现不同程度的增加，进一步揭示了细胞分裂素可以影响水稻的生长发育[18]。为了验证CKX对紫花苜蓿的影响，沙亚·海拉提通过克隆紫花苜蓿MsCKX，构建植物过表达载体pCAMBIA1302-MsCKX，得出紫花苜蓿MsCKX主要在植物的根和叶中表达，且MsCKX延缓了种子的萌发速率，提高了植物的耐盐性和抗旱性[16]；李殷睿智[17]等克隆得到了蒺藜苜蓿MtCKX基因，并由此发现此基因过表达可使转基因拟南芥中细胞分裂素的含量降低，间接证明了CKX可对植物的生长发育进程产生深远影响。

3 结论及展望

目前，关于CKX的结构、性质以及作用机理等方面的研究取得了一些进展，为进一步研究CKX的功能奠定了良好基础。受研究技术的限制，人们对植物CKX功能的研究进程仍然比较慢。随着基因克隆、转基因技术的快速发展，研究者可通过克隆植物CKX，观察其对植物生长发育的影响，间接获得CKX的功能。此方法已经初见成效，但是由于存在效率低、操作复杂等问题，对CKX的功能揭示还远远不够。

近年来，随着生物信息学以及基因组测序技术的发展，结合已经测序完成的植物全基因组序列，利用生物信息学软件对其基因组序列进行比对、分析，获取CKX的遗传、突变、编码、调控等信息，并比对其氨基酸序列，获取其蛋白质的空间结构、功能以及相互关系等信息，预测CKX在生物物质代谢、能量转移、信号传导等生命活动中的作用机理。利用最新发展的基因编辑技术CRISPR/Cas系统分析CKX序列，快速构建具有筛选标记的CRISPR载体，利用农杆菌转化法将其导入受体细胞，通过突变体后代的表型确定CKX的功能，为快速验证植物CKX在植物中的功能提供了一个强有力的工具。目前，关于CKX的研究主要集中在农作物方面，对其在林木植物以及观赏植物中的功能研究极少，今后可加强其在此类植物中的功能研究。