肾透明细胞癌中MRPS5的表达与患者预后的关系

(1.陆军军医大学第一附属医院肾科，重庆 400038；2.重庆医科大学第二附属医院泌尿肾病中心，重庆 401330；3.陆军军医大学免疫学教研室，重庆400038)

肾细胞癌简称肾癌，主要起源于肾小管上皮细胞，是泌尿系肿瘤中仅次于膀胱癌的第二大恶性肿瘤[1-2]。流行病学资料显示，在全球范围内，其发病率和病死率近年来呈快速上升趋势，严重危害人类的身心健康[3-4]。肾癌最主要的病理类型为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)，占全部肾癌的80%～90%[5]。肾癌对放化疗均不敏感，对于早期及局部进展期肾癌，目前首选治疗方法为外科手术，但术后复发率高，且有30%左右的患者会出现远处脏器转移；对于晚期肾癌，如今仍缺乏有效的治疗手段[6-7]。因此，进一步探索关于肾癌的生物标志物及治疗靶点日趋紧迫。

线粒体核糖体由一个28S小亚基和一个39S大亚基组成，是线粒体DNA(mtDNA)编码的mRNA翻译场所，负责线粒体电子传递链上部分蛋白的翻译，与细胞能量代谢密切相关[8]。近期研究发现，线粒体核糖体蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5,MRPS5)作为28S小亚基的成员，在肝癌、甲状腺癌、膀胱癌肿瘤组织中通过异常表达的方式调控肿瘤细胞生物学功能,进而影响肿瘤发生发展[9-11]。尽管前期研究已经证实MRPS5与上述肿瘤密切相关，可能是肿瘤调控的重要分子，但是其在肾癌中的作用国内外均未见报道。因此，本研究通过检测MRPS5在肾癌最主要的病理类型ccRCC中的表达，探讨其是否与ccRCC发生发展相关，以及是否有望作为判断预后的生物标志物和肿瘤靶向治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2007年1月至2012年10月陆军军医大学第一附属医院病理确诊为ccRCC的104例患者的石蜡包埋癌组织标本。其中男70例，女34例；年龄26～86岁，平均(53.64±13.41)岁；左侧肾癌53例，右侧肾癌51例；参照2010年AJCC肾癌分期标准[12]，TNM临床分期：Ⅰ～Ⅱ期95例，Ⅲ～Ⅳ期9例；Fuhrman分级:Ⅰ～Ⅱ级86例，Ⅲ～Ⅳ级18例。随访11～124个月，平均(81.17±22.07)个月，失访4例，随访率为96%。总生存期(overall survival,OS)为术后确诊至死亡的时间。无病生存期(disease free survival,DFS)为术后确诊至死亡、肿瘤复发或转移的时间。收集2018年4～8月陆军军医大学第一附属医院经病理确诊为ccRCC的新鲜癌组织和癌旁正常组织(距离肿瘤边缘2 cm以上)标本8对，将标本一分为二，一部分液氮罐保存，另一部分甲醛固定并石蜡包埋。病例纳入标准：①既往无其他重大疾病或恶性肿瘤病史；②术前尚未发现其他脏器转移；③手术方式为根治性肾切除术或部分肾切除术，局部病灶完整切除；④经病理证实均为ccRCC。排除标准：①术前接受过其他非手术治疗，如放化疗、生物治疗、分子靶向治疗等；②混合两种及两种以上病理类型的肾癌；③肿瘤组织内部出现大面积坏死。本研究通过陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学实验

先对8对新鲜癌组织和癌旁正常组织进行切片，再对104例石蜡包埋癌组织标本进行切片，均制备4 μm石蜡切片，经过二甲苯脱蜡，乙醇水化，EDTA缓冲液微波修复，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，5%BSA室温下封闭1 h，滴加兔抗人MRPS5单克隆抗体(美国origene,1∶200)并4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥，1∶800)室温孵育1 h，DAB显色，苏木紫染核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3 免疫印迹实验

8对新鲜癌组织及癌旁正常组织,每块组织取30 mg，加入300 μL蛋白裂解液，研钵中研磨至匀浆，12 000 r/min 4 ℃离心15 min后取上清，检测蛋白浓度，后加入5×Loading buffer，沸水煮15 min，加入等量蛋白至聚丙烯胺凝胶电泳、转膜，5%BSA封闭1 h，兔抗人MRPS5单克隆抗体(美国origene,1∶1 000)孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育，显色、曝光后进行图像分析。

1.4 免疫组织化学评分标准

请两位经验丰富的病理科医生独立进行双盲评分，取双方评分的均值。每张切片在200倍的高倍镜下随机选择10个视野。阳性着色强度：无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。阳性细胞百分比：阳性细胞率≤5%记为0分，6%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，≥76%记为4分。阳性着色强度和阳性细胞百分比计分的乘积即为总评分，6分及以上为相对高表达，4分及以下为相对低表达。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。χ2检验分析MRPS5表达水平与患者临床病理参数的关系。Kaplan-Meier法描绘生存曲线，Log-rank检验MRPS5表达水平与患者生存状况的关系。采用Cox比例风险回归模型分析影响预后的临床因素。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRPS5在ccRCC癌和癌旁正常组织中的表达

利用新鲜癌组织及癌旁正常组织标本进行实验，免疫组织化学实验结果显示：MRPS5主要表达于肾小管及集合管上皮细胞，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。MRPS5在癌旁正常组织中可见广泛大量的表达，而在癌组织中，其表达量较低(图1a)。免疫印迹实验结果与免疫组织化学实验一致：与癌旁正常组织相比，MRPS5在癌组织中的表达水平明显降低(图1b)。

2.2 MRPS5表达水平与ccRCC患者临床病理参数的相关性分析

为了进一步探索MRPS5在ccRCC中的临床应用价值，本研究对104例石蜡包埋ccRCC癌组织切片进行了免疫组织化学实验并按照评分标准进行了评分,结果发现：高表达组64例(61.5%)，低表达组40例(38.5%)。统计学分析发现，MRPS5相对表达水平与患者性别、年龄、肿瘤位置、大小、N分期、TNM临床分期及Fuhrman分级等临床病理参数无明显相关性(P>0.05)，而与T分期及肿瘤坏死显著相关(P<0.05)，见表1。

a:免疫组织化学检测;b:免疫印迹检测 T:癌组织;N:癌旁正常组织

表1 MRPS5表达水平与ccRCC患者临床病理参数的相关性分析[例(%)]

临床参数nMRPS5水平低表达高表达χ2P性别男7028(40.0)42(60.0)0.2140.644女3412(35.3)22(64.7)年龄≤55岁5620(35.7)36(64.3)0.3870.534>55岁4820(41.7)28(58.3)肿瘤位置左5320(37.7)33(62.3)0.0240.877右5120(39.2)31(60.8)长径≤4cm5818(31.0)40(69.0)3.0560.080>4cm4622(47.8)24(52.2)T分期T1～T29734(35.1)63(64.9)5.1010.024T3～T40706(85.7)01(14.3)N分期N09938(38.4)61(61.6)0.0001.000N10502(40.0)03(60.0)TNM临床分期Ⅰ～Ⅱ9534(35.8)61(64.2)2.1350.144Ⅲ～Ⅳ0906(66.7)03(33.3)Fuhrman分级Ⅰ～Ⅱ8630(34.9)56(65.1)2.6870.101Ⅲ～Ⅳ1810(55.6)08(44.4)肿瘤坏死无8127(33.3)54(66.7)4.0700.044有2313(56.5)10(43.5)

2.3 MRPS5表达水平与ccRCC患者生存状况的相关性分析

采用Kaplan-Meier法对104例ccRCC患者的生存状况进行分析，结果显示：MRPS5高表达组平均OS为114.437个月，95%CI(109.978,118.897)；低表达组平均OS为105.518个月，95%CI(93.946,117.090)；MRPS5高表达组平均DFS为113.563个月，95%CI(108.352,118.773)，低表达组平均DFS为104.609个月，95%CI(92.393,116.825)。采用Log-rank检验比较不同患者生存状况的差异，结果显示，MRPS5高表达组的OS与低表达组存在显著差异(P=0.022)；MRPS5高表达组的DFS与低表达组亦存在显著差异(P=0.028)。因此，初步推断MRPS5高表达组患者生存状况优于低表达组(图2)。

图2 Kaplan-Meier法描绘不同MRPS5水平患者的OS及DFS曲线

2.4 单因素及多因素Cox回归分析

单因素Cox回归分析发现，ccRCC患者OS和DFS均与肿瘤大小、T分期、N分期、TNM临床分期、Fuhrman分级、肿瘤坏死及MRPS5表达水平等多种因素相关(P<0.05)，见表2。进一步进行多因素Cox回归分析发现，患者OS和DFS均与N分期、Fuhrman分级、MRPS5表达水平因素相关(P<0.05)，见表3。N分期为N1(即有淋巴结侵犯)、Fuhrman分级越高及MRPS5表达水平越低的患者预后更差，MRPS5低表达是影响患者OS及DFS的独立危险因素。

表2 单因素Cox回归分析

表3 多因素Cox回归分析

3 讨论

线粒体核糖体蛋白是线粒体核糖体必不可缺少的组成部分，参与线粒体电子传递链上部分蛋白的翻译，其结构或功能异常会引起线粒体氧化磷酸化效率降低，导致不同程度的能量代谢障碍，有些甚至会使线粒体不能维持基本的能量代谢而引起致死性疾病[13]。越来越多的证据表明线粒体核糖体蛋白在细胞凋亡信号转导、机体抗衰老和细胞增殖调控方面发挥着重要作用[14-15]。

MRPS5是线粒体核糖体28S小亚基的结构蛋白，参与线粒体能量代谢功能的调节，与多种肿瘤的发生发展密切相关。早期研究发现，其通过线粒体能量代谢障碍的途径调控线虫和小鼠寿命的同时可以调控肿瘤的生长，是一种长寿相关蛋白[16]。随后也证实了其他长寿调控基因如Sir2、lin2、dct2、nnt-1等与肿瘤的发生发展密切相关[17-19]。Wei等[9]的研究发现，MRPS5在肝癌中可以通过代谢重编程的方式来调控肿瘤干细胞的生长，其过表达可引起肿瘤细胞恶性转化，导致预后不良。刘启梁等[11]的研究发现，MRPS5也可以调节膀胱癌细胞增殖能力，影响其干细胞干性特征，其过表达同样提示预后不良。但Lee等[10]发现，在甲状腺乳头状癌中，MRPS5在癌组织中呈低表达，在癌旁组织中呈高表达，低表达组的颈部淋巴结侵犯的风险明显高于高表达组，可以作为淋巴结侵犯的预测因子。与Lee等[10]的研究结果类似的是，本研究发现ccRCC癌组织MRPS5表达明显低于癌旁正常组织，其在癌组织中表达水平与肿瘤T分期和肿瘤坏死这两种临床病理参数具有明显相关性，且不同表达水平所对应的临床预后明显不同，从生存曲线可以看出低表达组的OS和DFS均明显短于高表达组。

此外，单因素回归分析表明肿瘤大小、T分期、N分期、TNM临床分期、Fuhrman分级、肿瘤坏死及MRPS5表达水平等是影响患者生存状况的因素；多因素回归分析显示，除了MRPS5低表达外，N分期和高Fuhrman分级也是影响患者预后的独立危险因素。张乾等[20]报道指出，发生淋巴结转移的肾癌患者即使行外科手术治疗，术后复发率也会显著增高。众所周知，Fuhrman分级是肾癌最常用的组织学分级，低级别(即Ⅰ～Ⅱ级)的患者往往预后更好，行保留肾单位的手术安全性更佳。Chen等[21]的研究发现，Fuhrman Ⅲ～Ⅳ级是肾癌患者5年复发的独立预测因素。Mir等[22]的回顾性研究认为，临床医生在决定早期肾癌是否行保留肾单位的部分切除术时，Fuhrman分级是一个重要的参考因素，对最终的决策具有指导意义。所以，发生淋巴结侵犯、Fuhrman分级越高或MRPS5表达水平越低往往提示患者预后不良。

综上所述，MRPS5在肿瘤的发生发展中具有重要意义。本研究初步证实了在ccRCC中MRPS5的表达水平与多种临床病理参数相关，不同表达组间的预后差异显著，低表达的患者预后明显不良，MRPS5低表达是影响患者预后的独立危险因素，有望成为判断ccRCC预后的生物标志及研发治疗药物的新靶点。然而目前其在ccRCC中发挥作用的分子机制尚不清楚，这需要后续进一步研究探讨。