云南普洱江城县草地贪夜蛾幼虫肠道中可培养细菌的分离及鉴定

张凌英，苏造堂，徐天梅，张志红，郑亚强，桂富荣，2**，陈 斌*

(1. 云南农业大学植物保护学院, 昆明 650201；2. 云南省高原特色农业产业研究院, 昆明 650201)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)又名秋粘虫，隶属于鳞翅目Lepiodoptera夜蛾科Noctuidae。它是一种源于美洲大陆的毁灭性农业害虫，具有飞行能力强、增殖数量大、寄主种类多、种群优势明显、突发危害严重等特点(Todd and Poole，1980)。该虫于2019年1月首次迁入我国云南省普洱市江城县(杨学礼等，2019)，之后迅速向我国其他省区蔓延，现已成为严重影响玉米生产的重要害虫(齐国君等，2019)。张丽红(2019)研究发现该虫对很多农药如有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类具有抗药性，防治困难。

昆虫肠道存在着种类多、数量大的微生物类群，这些微生物与昆虫行为有着密切联系，比如在躲避天敌(张振宇，2017)、增强抗药性(Chengetal., 2017)及适应生态位变化(Chengetal., 2019)等过程中具有重要作用。为了适应不同环境条件，这些微生物也随之发生进化，然而肠道微生物的多样性与昆虫的种类、地域、食物及外界环境等有关(Corbyharrisetal., 2007; Zhangetal., 2018)，导致同种昆虫会因其食物、地理环境或者生长发育的差异而表现出种类和数量不同的微生物，也表现出不同种昆虫在取食相同食物、经历相同的环境变化及同一地区其肠道中微生物的种类和数量也不同(Chenetal., 2018)。昆虫体内大部分细菌属于变形菌门，但是多数研究表明，厚壁菌门同样是鳞翅目昆虫肠道中的优势菌群(陈勃生等，2017)。国外，美国和巴西已对草地贪夜蛾肠道微生物开展了研究(Acevedoetal.，2017；Almeidaetal.，2017)，而国内相关研究报道较少。本研究采集江城县宝藏镇水城村勐野坝地区玉米田中的草地贪夜蛾为样本，通过传统培养法以及16S rRNA测序对草地贪夜蛾的肠道优势菌进行了初步分离鉴定，以期为后续的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

虫源：采集于江城县宝藏镇水城村勐野坝玉米田，海拔790 m，E101.63°，N22.68°。

LB培养基：10 g氯化钠，5 g酵母浸粉，10 g胰蛋白胨，15～20 g琼脂，pH7.0，dd H2O：1 L，121℃高压(101 kPa)蒸汽灭菌20 min(黄秀梨和辛明秀，2008)。

NA培养基：5 g氯化钠，5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，15～25 g琼脂，pH7.4～7.6，dd H2O：1 L，121℃高压(101 kPa)蒸汽灭菌20 min(黄秀梨和辛明秀，2008)。

试验仪器：超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1FD)、高压蒸汽灭菌锅(申安，LDZM-40KCS-Ⅱ)、恒温培养箱(恒立，RG-300)、离心机(恒诺，2～16R)、PCR仪(美国伯乐，T100)、电泳仪(美国伯乐，1645050 )、显微镜(德国莱卡，ICC50W)。

1.2 研究方法

1.2.1草地贪夜蛾中肠肠道原液的制备

取5头健康的草地贪夜蛾5龄幼虫，饥饿1 d，用无菌水清洗幼虫体表的污染物，再用75%消毒酒精对幼虫体表消毒4 min，最后放入无菌水中清洗表面的酒精。在放有灭菌的磷酸缓冲液的灭菌培养皿中，用镊子从虫体尾部取出肠道，用镊子小心去除前肠和后肠以及部分马氏管，将处理好的中肠放入1.5 mL无菌离心管中并用尖镊子捣碎，加入少量灭菌的磷酸缓冲液使捣碎的肠道成匀浆状，最后继续加入磷酸缓冲液定容至1 mL，以此作为肠道原液备用(郑亚强等，2017)。

1.2.2肠道原液中细菌的分离及纯化

将准备好的肠道原液取0.1 mL于含有0.9 mL磷酸缓冲液离心管配制成10-1，按照此方法依次类推分别稀释到10-3～10-8稀释浓度梯度。用移液枪分别从6个浓度梯度中从低到高取0.1 mL均匀涂布于两种固体培养基，重复3次。把涂布好的固体培养基放置于30℃恒温条件下培养，24 h后挑选出菌落数在30～300的平板，统计各平板上菌落颜色、形态和大小各异细菌菌落的数量，并用接种环挑取不相同的单菌落多次平板划线，直到获得纯菌株。将纯化好的菌株分别编号，并且对每个编号下的菌株进行革兰氏染色，通过莱卡显微镜(100×物镜)观察。

1.2.3细菌菌株分子鉴定及系统发育分析

本研究采用冻溶法提取细菌DNA，具体操作如下：分别从已经纯化好的LB或者NA平板中挑取单菌落于1.5 mL无菌离心管中，然后加入0.5 mL无菌蒸馏水涡旋振荡混匀。然后将混匀后的菌悬液于装有液氮的冰盒中冷冻10 min，紧接着将离心管固定在泡沫漂盘上沸水浴5 min，最后 12 000 r/min高速离心2 min(冯广达等，2013)，以上清液作为PCR模板。

1.2.4采用细菌通用引物27F和1492R(郑亚强等，2017)，扩增体系与条件如下：

反应条件: 94℃热变性5 min；94℃变性1 min；53℃退火1 min；72℃延伸2 min；32个循环，72℃延伸10 min。

PCR产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将达标PCR产物送上海生物工程股份有限公司进行双向测序。

表1 PCR 反应体系

1.3 数据分析

计算每种菌菌株的相对丰度，计算公式为：相对丰度(%)=某种菌菌落数/总菌落数×100。

利用Contigexpress软件对双向测序原始序列进行拼接和校对，并切除首尾乱序形成一条较为完整的序列，提交至NCBI(GenBank)数据库进行比对，查找并下载与各菌株具有最高相似度的同源序列。将下载的序列通过MEGA 7.0软件，采用通用的邻位相连法(Neighbour-Joining)、Kimura双参数矫正模型构建系统发育树，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自导复制评价系统发育树的稳定性。

2 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾肠道可培养细菌的形态学特征

从稀释涂布培养的LB和NA培养基上得到菌落形态各异的18个细菌菌株。其中共有12种典型的颜色、形状、大小各不相同的细菌菌落，其菌落的形态为圆形和不规则形，且圆形较多；颜色有白色、乳白色、黄色、淡黄色、红色(表2)。通过革兰氏染色后，11株显示为阳性，7株显示为阴性。100×物镜下观察到其细胞形态10株为球形，4株为杆状，3株为短杆状，1株为棒状。

2.2 草地贪夜蛾5龄幼虫肠道细菌的16S rRNA序列分析结果

将草地贪夜蛾肠道中分离得到的18株可培养细菌通过16S rRNA序列分析法进行鉴定，将校对好的测序结果与NCBI中模式菌株序列进行相似性对比。结果如表3所示，它们分别属于2门2纲4目 6科8属：与肠球菌属Enterococcus相似性在99%以上的有8株、与芽孢杆菌属Bacillus相似性在99%以上的有1株、与巨球菌属Macrococcus相似性在99%以上的有1株、与葡萄球菌属Staphylococcus相似性在99%以上的有1株、与普罗威登斯菌属Providencia相似性在99%以上的有1株、与克雷伯氏菌属Klebsiella相似性在99%以上的有2株、与沙雷氏菌属Serratia相似性在99%以上的有2株、与不动杆菌属Acinetobacter相似性在99%以上的有1株。

表2 草地贪夜蛾5龄幼虫肠道细菌的菌落形态及培养性状

续表2 Continued table 2

菌株编号Strain No.革兰氏染色Grams dyeing菌体形状Strain morphology培养特征Culture characterNR03+球形Spherical圆形,边缘规则透明,乳白,凸起,湿润,较小。Round,Regular and transparent edges,Creamy White,Bulge,Moist,Smaller.105341+球形Spherical圆形,边缘规则,淡黄色,扁平,半透明,湿润,较小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105142+球形Spherical圆形,边缘规则,淡黄色,扁平,半透明,湿润,较小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.104122+球形Spherical圆形,边缘规则,淡黄色,扁平,半透明,湿润,较小。Round,Regular edge,Yellowish,Flat,Translucent,Moist,Smaller.105321+球形Spherical圆形,边缘规则,黄色,扁平,半透明,湿润。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.104242+球形Spherical圆形,边缘规则,黄色,扁平,半透明,湿润。Round,Regular edge,Yellow,Flat,Translucent,Moist.103311+杆状Rod-shaped圆形,边缘放射状透明,淡黄色,扁平,不透明,半湿润。Round,Ra-dially transparent margin,Yellowish,Flat,Opaque,Semi humid.10351+球形Spherical圆形,边缘规则,黄色,凸起,不透明,湿润。Round,Regular edge,Yellow,Bulge,Opaque,Moist.NR05+球形Spherical不规则,边缘细小瓣状,黄色,中央微凸有褶皱,不透明,湿润。Irregu-lar,Edge small petal,Yellow,Center slightly convex with fold,Opaque,Moist.NR01-杆状Rod-shaped圆形,边缘规则,黄色到淡黄,凸起,不透明,湿润,有光泽。Round,Regular edge,Yellow to yellowish,Bulge,Opaque,Moist,Glossy.10412-短杆状Short rod圆形,边缘规则,白色,高凸,湿润,有光泽。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.NR04-短杆状Short rod圆形,边缘规则,白色,高凸,湿润,有光泽。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.104111-短杆状Short rod圆形,边缘规则,白色,高凸,湿润,有光泽。Round,Regular edge,White,High bulge,Moist,Glossy.10461-杆状Rod-shaped圆形,边缘规则,深红,高凸,湿润,有光泽。Round,Regular edge,Crimson,High bulge,Moist,Glossy.NR02-杆状Rod-shaped圆形,边缘规则,初期深红后期四周褪色,高凸,湿润,有光泽。Round,Regular edge,Early crimson and late four week fading,High bulge,Moist,Glossy.NR06-棒状Stick-shaped圆形,边缘规则,白色,凸起,湿润,有光泽。Round,Regular edge,White,Bulge,Moist,Glossy.

注：其中编号为10351-105341为LB培养基分离得到的菌株，编号为NR01-NR06为NA培养基分离得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

表3 草地贪夜蛾5龄幼虫肠道细菌的16S rRNA序列比对分析结果

注：其中编号为10351-105341为LB培养基分离得到的菌株，编号为NR01-NR06为NA培养基分离得到的菌株。
Note: The strains numbered 10351-105341 were isolated from LB medium and NR01-NR06 was isolated from NA medium.

2.4 草地贪夜蛾5龄幼虫肠道细菌鉴定结果

综合各菌株的培养性状、菌体形态和染色反应等各项指标，共鉴定出细菌2门2纲4目6科8属。其中从LB培养基中分离到2门2纲3目 4科 5属，分别为肠球菌属、芽孢杆菌属、巨球菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属，其中肠球菌属所占比例最高为65.06%。从NA培养基中分离到2门2纲4目6科6属，分别为肠球菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属，其中肠球菌属所占比例同样最高为44.20%(图1)。可以确定肠球菌属是草地贪夜蛾5龄幼虫肠道中的优势属，且种水平多样性最高。通过LB培养基和NA培养基获得隶属于该属的菌株有3种，分别为蒙氏肠球菌Enterococcusmundtii、铅黄肠球菌Enterococcuscasseliflavus和鹑鸡肠球菌Enterococcusgallinarum(表4)。

表4 草地贪夜蛾5龄幼虫肠道可培养细菌鉴定结果及存在数量

图1 LB(A)和NA(B)培养基上分离细菌在属分类水平的群落组成Fig.1 The composition of bacteria community isolated from LB(A)and NA(B)media at genus level

3 结论与讨论

本研究通过细菌通用培养基LB培养基和NA培养基从草地贪夜蛾中肠中总共分离到18株细菌，隶属于2门2纲4目6科8属。在门水平上本研究分离得到的两个门分别是变形菌门和厚壁菌门，这与Snyman等(2016)报道的在鳞翅目昆虫肠道中微生物的优势门具有一致性。在属水平上，所分离到的菌株分别为肠球菌属、芽孢杆菌属、巨球菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、萄球菌属、普罗威登斯菌属、不动杆菌属，其中肠球菌属的丰度最高，分别占LB培养基和NA培养基所有分离菌株的65.06%和44.20%，可以确定该属是云南江城地区草地贪夜蛾5龄幼虫肠道中的优势属。据报道，肠球菌属有很多种类能够产生乙酸盐，进一步调节昆虫肠道内的pH值，起到保护昆虫免被毒素毒害的功能(张珏锋等，2013)；克雷伯氏菌属的一些菌株可降解部分有机磷杀虫剂如：毒死蜱、敌百虫；同时也能降解少部分菊酯类杀虫剂如：溴氰菊酯。不动杆菌属细菌的一些菌株可降解溴氰菊酯(南春燕，2013)。然而，草地贪夜蛾肠道中分离到的这些细菌是否具有降解农药的作用，值得进一步深入探究。

国外，巴西学者从大豆饲养的草地贪夜蛾 5龄幼虫肠道中分离到8个属的细菌(Almeidaetal.，2017)，分别为肠球菌属Enterococcus、节细菌属Arthrobacter、勒克氏菌属Leclercia、细杆菌属Microbacterium、代尔夫特菌属Delftia、假单胞菌属Pseudomonal和葡萄球菌属Staphylococcus。美国从玉米叶饲养第14代的草地贪夜蛾3龄幼虫肠道中分离到5个属的细菌，分别为肠杆菌属Ebterbacter、拉恩氏菌属Rahnella、克雷伯氏菌属Klebsiella、拉乌尔菌属Raoutella、和泛菌属Pantoea(Acevedoetal.，2017)。我国唐运林等(2019)对采自重庆玉米地的草地贪夜蛾幼虫肠道中发现8个属的细菌，分别为克雷伯氏菌属Klebsiella、假单胞菌属Pseudomonas、不动杆菌属Acinetobacter、气单胞菌属Aeromonas、肠杆菌属Enterobacter、金黄杆菌属Chryseobacterium、短波单胞菌属Brevundimonas以及肠球菌属Enterococcus。与巴西、美国、及重庆3个地方的研究相比，云南江城地区与以上地区的草地贪夜蛾肠道细菌存在一定的重合性，这可能是由于同一物种肠道微环境具有一定保守性导致的。同时也存在明显差异性，芽孢杆菌属Bacillus、沙雷氏菌属Serratia、巨球菌属Macrococcus、普罗威登斯菌属Providencia等4个属在云南省江城县玉米田草地贪夜蛾肠道中分离获得，而在文献报道的其他地区未分离到，究其原因可能与地理位置、宿主植物、饲养代数以及龄期等差异有关，然而具体原因将是进一步研究的重要内容。此外，昆虫肠道细菌是影响昆虫生长发育、抗药性和迁飞等习性的重要因素(张振宇等，2017)，然而草地贪夜蛾肠道中这些细菌是否也会影响草地贪夜蛾的抗性和生长发育等，还有待进一步研究。