润燥明目汤对急性高眼压大鼠视网膜及其组织Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响

万 宇, 李战梅, 黄 海, 黄学文, 何艺岚

(南充市中心医院眼科, 南充 637000)

高眼压症是从原发性开角型青光眼的诊治过程中发现的一种特殊症状，在临床实践中也发现，绝大多数确诊的青光眼患者都具有眼压升高的共同特征[1,2]。其发病机制尚未明确，但降低眼压依然是治疗青光眼最主要的措施之一。目前，青光眼的治疗包括谷氨酸拮抗剂、基因调控、钙离子阻滞剂等手段，但在不同的患者中其疗效差别较大[3,4]。近年来，祖国医学通过中医针灸、中药干预等特色疗法在青光眼视神经保护方面取得了重大进展[5]。润燥明目汤对青光眼具有良好的效果，但关于其对高眼压症的疗效研究报道较少。因此，本研究将通过构建大鼠高眼压动物模型初步探讨润燥明目汤保护急性高眼压大鼠视神经的作用及可能机制，旨在为临床治疗高眼压症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器

SPF级雄性SD大鼠，体质量(230±60) g, 购自第三军医大学第三附属医院野战外科研究所[SCXK(渝)-2017-0005]，饲养于南充市中心医院外科动物实验室[SYXK(渝)2017-0009]。动物实验经南充市中心医院动物伦理委员会审批(文号20180516089)。润燥明目汤由我院药剂科配置, 方剂包括生地12 g，丹皮l0 g, 白芍12 g，麦冬12 g, 石斛20 g，南沙参12 g，黄芪15 g，山茱萸12 g，淡竹叶9 g，置煎药壶中加水煎煮30 min,去渣取汁，将汁浓缩为干膏, 其得膏率为18.2%。按不同剂量以灌胃方式给药，每日1次。

Tono-penⅡ眼压计购自美国Medtronic SALON 公司, 光学显微镜、透射电子显微镜均购自日本日立株式会社, 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷氨酸(Glu)及Ca2+试剂盒均购自自南京建成生物工程研究所科技有限公司，酶标仪购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 模型构建及分组

将60只SD大鼠随机分为6组，根据处理方式的不同分为空白组、单纯模型组、阳性药物组(银杏叶片，210 mg/kg)、润燥明目汤低剂量组、中等剂量组及高剂量组。空白组: 不做任何处理,正常饲养，采用生理盐水灌胃每日1次3 mL。单纯模型组：参考赵瑛等[6]的方法建立大鼠急性高眼压模型，质量分数4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定，林可霉素冲洗眼部后行角膜表面麻醉。将生理盐水瓶悬置于液平面至大鼠角膜顶点垂直距离136 cm处 (此高度可在大鼠眼内形成 100 mmHg的眼内压[2])，将连接生理盐水瓶输液管的5号头皮针针尖沿角膜缘刺人前房 ，为避免损伤虹膜和晶状体，针头斜面向上，针尖平行于瞳孔缘迅速推进，切勿穿破角膜，固定 。轻轻打开输液器开关，当输液瓶内的液体向眼内滴注时，可见球结膜苍白，虹膜迅速变白，用检眼镜检查可发现视网膜苍白水肿，说明视网膜中央动脉的供血已被完全阻断。持续60 min后，缓慢拔除针头，涂擦红霉素眼膏预防感染。分笼饲养，自然饮食。阳性药物组、润燥明目汤低、中和高剂量组：急性高眼压模型构建方法同单纯模型组，从造模第2日开始，采用润燥明目汤每日按10 mL/kg、15 mL/kg和20 mL/kg灌胃，给药剂量换算为(按照临床70 kg成人用量和体表面积进行换算), 银信叶片给药剂量参考相关文献。

1.3 大鼠眼压测量

在造模前、造模后即刻、用药后8周共3个时间点对大鼠眼压进行测量, 采用Tono-pen AVIA笔式眼压计进行。测量时，先采用奥布卡因滴眼液进行表面麻醉，计量器轻触角膜至少10次以上。记录眼压值。操作由1人完成，至少操作3次取平均值，测量过程中剔除显著异常值。

1.4 HE染色

用药8周实验结束后采用过量麻醉法处死大鼠，取下右眼眼球，留取部分眼球后视神经组织，质量分数4%多聚甲醛溶液固定视神经组织，常规石蜡包埋，切片，烤片，冷却后低温冻存。经二甲苯脱蜡，乙醇溶液梯度水化。苏木精染色30～60 s, 冲洗5 min, 伊红染色30 s，冲洗5 min; 乙醇溶液梯度脱水，干燥，二甲苯透明, 中性树胶封固, 晾干, 光学显微镜下观察。

1.5 视网膜组织中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+检测

取下视网膜组织，摘除晶状体和玻璃体，小心分离视网膜组织，移入EP管，吸进水分后称重，加入冰生理盐水，剪碎。用破碎仪制作视网膜组织匀浆，在200r/min、室温下离心8 min，分别参照SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+的说明书操作方法，采用比色法对各指标进行检测。

1.6 RT-PCR检测细胞凋亡相关因子Caspase-3 Bcl-2和Bax mRNA表达

处死大鼠后, 解剖出视网膜组织。采用Trace试剂盒，提取DNA，洗脱后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA完整性。95 ℃预变性3 min, 95 ℃30 s, 退火温度40 s, 72 ℃30 s, 40个循环，设置荧光反应在每个扩增周期后80℃10 s的条件下进行，最后72 ℃持续5 min。引物模板见表1。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用s表示，组间比较的统计分析采用多因素方差分析检验，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表 1 CXCL12及CXCR4引物模板

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点眼压比较

造模前, 各组大鼠的眼压无明显差异(P＞0.05)。造模后即刻，空白组无明显变化，其他组大鼠眼压显著升高(P＜0.05)。用药后8周, 高剂量组大鼠眼压较模型组及低、中干预组显著降低(P＜0.05),与阳性药物组相比高剂量干预组其眼压变化没有统计学意义(表2)。

2.2 各组大鼠视网膜形态

正常组视网膜结构中视网膜组织结构完整(图1A)。单纯模型组大鼠，视网膜组织明显水肿，可见空泡变性(图1B)。阳性药物组大鼠的神经纤维层、细胞层水肿明显较低，空泡样变形较少，结构截完整(图1C)。润燥明目汤低剂量组及中剂量干预组大鼠的神经纤维层、细胞层水肿明显，空泡样变性较多，结构紊乱(图1D、E)，而高剂量干预组的视网膜损伤程度明显减轻，视网膜水肿位置较为局限，外层组织水肿显著减轻，大部分结构恢复(图1F)。

表 2 各组大鼠不同时间点眼压比较 mmHg

2.3 各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比较

与空白组大鼠相比，单纯模型组大鼠视神经组织中SOD活性显著降低，而MDA、NO、Glu、Ca2+水平明显升高(P＜0.05)。与单纯模型组大鼠相比，阳性药物组及各干预剂量组大鼠的相关指标均存在显著变化(P＜0.05)。随着治疗剂量的升高，与阳性药物组相比，润燥明目汤高剂量干预组大鼠视网膜组织中NO、Glu水平呈显著下降(P＜0.05)(表3)。

图 1 各组大鼠视网膜HE染色(HE×200)

表 3 各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、NO、Glu、Ca2+比较 (每mg视网膜组织)

2.4 各组大鼠视网膜神经节细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均积分吸光度

与空白组相比, 单纯模型组大鼠视网膜神经节细胞中的Bcl-2吸光度明显降低、Bax、Caspase-3平均积分吸光度均显著升高(P＜0.05); 与单纯模型组相比, 随着润燥明目汤剂量的增加, 各剂量干预组及阳性药物组大鼠的Bcl-2平均积分吸光度均显著增加, 其差异具有统计学意义(P＜0.05), Bax、Caspase-3平均积分吸光度均显著升高(P＜0.05); 与阳性药物组相比, 而高剂量干预组大鼠Bax、Caspase-3的平均积分吸光度显著下降(P＜0.05)(表4)。

2.5 各组大鼠视网膜神经节细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相对表达量

与空白组组相比, 单纯模型组大鼠视网膜神经节细胞中Bcl-2 mRNA明显降低、Bax、Caspase-3 mRNA均显著升高(P＜0.05); 与单纯模型组相比, 随着给药剂量的升高及阳性药物的干预, 各组大鼠视网膜神经节细胞中的Bcl-2 mRNA相对表达量逐渐升高, Bax、Caspase-3 mRNA的相对表达量逐渐下降, 均呈现出剂量依赖性(P＜0.05); 与阳性药物组相比，高剂量润燥明目汤干预组大鼠Bcl-2及Bax mRNA明显降低(P＜0.05)(表5)。

表 4 各组大鼠视网膜神经节细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3平均积分吸光度

表 5 各组大鼠视网膜神经节细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相对表达量

3 讨论

绝大多数青光眼患者因眼压升高导致不可逆转致盲性眼病。研究[7]报道，细胞凋亡参与青光眼神经节细胞丢失。其中视网膜神经节细胞损伤及小梁细胞凋亡在青光眼发病过程中所发挥的作用引起研究者的关注。在高眼压作用下视网膜神经节细胞染色体明显浓缩、靠边，胞质中有多个比核小而浓缩的小体(即凋亡小体), 并有膜包绕。这种形态异常表明青光眼中视网膜神经节细胞发生凋亡。小梁网通常被认为在眼内压调节中起着关键作用, 高眼压状态下, 小梁细胞凋亡被激活，启动凋亡程序，通过多种途径打破 bcl2 家族的平衡，使 bax mRNA 表达量增加，bcl-2 mRNA表达量减少，导致细胞凋亡发生率明显增加 。

由于缺乏警惕性，导致早期青光眼的隐匿性高，许多患者初次确诊时就已难以根治、无法逆转[8]。而在祖国医学中, 将青光眼归于五风内障范畴, 病因病机与机械性损伤、缺血性损伤及免疫损伤等相似, 但关于其具体发病机制也无明确共识。

本研究中, 我们初步探讨润燥明目汤对诱导大鼠高眼压模型的保护机制。动态监测眼压后发现,在造模后即刻, 大鼠眼压显著升高, 表明模型构造成功。用药后8周，单纯模型组、低剂量组、中剂量组眼压无明显差异，但高剂量组大鼠眼压显著降低, 表明高剂量的润燥明目汤对缓解眼高压有一定的作用。经HE染色后观察视网膜形态发现，与空白组相比，单纯模型组大鼠的视网膜明显水肿，各层结构完整，可见空泡变性; 润燥明目汤低剂量干预组及中剂量干预组大鼠的神经纤维层、细胞层水肿明显，结构紊乱; 高剂量干预组的视网膜损伤程度明显减轻，视网膜水肿位置较为局限, 外层组织水肿显著减轻, 大部分结构已恢复。这表明，高剂量的润燥明目汤对受损的视网膜结构有一定的改善功能，可部分恢复视神经组织形态, 这一结论与刘蓓等[9]研究结果相一致。

SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用[10]。MDA是氧自由基与脂质过氧化反应的终产物，其表达水平的高低可直接反映细胞氧化损伤的程度[11]。NO则可通过产生神经毒作用诱导细胞凋亡[12]。研究[6]表明，银杏提取物抗氧化应激、清除自由基、保护线粒体等多种生物功能，还能有效保护高眼压模型的视神经细胞的凋亡。目前, 银杏叶片已经作为临床用药。在本研究中，将银杏叶片作为阳性药物组，通过比色法检测后发现，与单纯模型组相比，各给药剂量组及阳性药物组的相关指标均存在显著差异，且与阳性药物组相比，高剂量干预组大鼠视网膜组织中NO、Glu水平呈显著下降(P＜0.05)。这一结果表明，一定剂量的润燥明目汤可有效抑制自由基氧化作用的同时, 其中对NO、Ca2+抑制作用强于银杏叶片组，该结论与胡瑾等[13]研究结果相似。

Caspases家族成员是存在于胞质溶胶中的半胱氨酸蛋白酶，可以选择性地对多种信号转导途径中的蛋白质进行高效切割，参与调节多种生物过程，如程序性细胞死亡，炎症，细胞分化、增殖和运动[14]。BCL-2蛋白位于细胞内膜如内质网和线粒体, 一些家族成员在细胞死亡的刺激下从细胞质移位到线粒体[15], 参与调节细胞凋亡。在本研究中, 通过RT-PCR检测发现, 随着润燥明目汤干预剂量的升高, 各组大鼠视网膜神经节细胞中的Bcl-2 mRNA相对表达量显著升高, Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相对表达量明显下降，均呈现出剂量依赖性。而Caspases与细胞程序性死亡密切相关，当出现高眼压后，急性的缺血再灌注损伤会诱导大量视网膜神经元凋亡，作为细胞凋亡胞内信号的主要传递者，Caspases表达量会明显上调。在本研究中, 各干预组Caspase-3 mRNA及Bax mRNA的表达量明显下调，表明润燥明目汤可通过调节Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路活化发挥降低高眼压、保护视神经作用。

综上所述，润燥明目汤干预急性高眼压大鼠，对视神经有明显的保护作用，这可能与抑制Caspase-3/Bcl-2/Bax信号通路活性有关，为临床上治疗高眼压患者的视神经损伤提供实验依据，但具体的分子学机制有待进一步探讨。