《盐酸小檗碱脂质体制备》实验的制备方法综述*

郑峙澐，单 爽，曹子琴，王 茜，马格非，彭 灿，储晓琴， 桂双英，尹登科，何 宁

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

盐酸小檗碱属于异喹啉类生物碱，是从黄连等植物中提取出来的。它作为一种抗菌药疗效确切，已被广泛用于肠胃炎、细菌性痢疾等消化道疾病的治疗，对治疗心力衰竭、高血压、高血脂也有较好的疗效[1]。研究证实，盐酸小檗碱可对多种肿瘤发挥抑制作用，但其体内抑瘤作用较体外差，原因可能是盐酸小檗碱在肠道很难被吸收，体内抑瘤浓度也较低[2]。因此，如何使盐酸小檗碱在体内发挥有效的抑瘤作用成为首要问题。脂质体是一种新型制剂技术，结构与细胞膜相似。它是由脂质材料(例如磷脂)分散在水性介质中形成的封闭囊泡，具有靶向性和缓释作用，适合于生物体内降解，同时可减少用药剂量、降低毒副作用，故脂质体的应用已越来越广泛[3]。目前，盐酸小檗碱脂质体的制备方法主要有薄膜分散法、逆向蒸发法、溶剂注入法、pH梯度法、硫酸铵梯度法、薄膜分散-pH梯度法、超临界CO2法等等，每种方法各有优缺点，本文主要通过对国内外关于盐酸小檗碱脂质体的制备方法进行综述，比较不同方法的制备工艺和优缺点，以期为药剂学实验教学和实验设计提供参考。

1 薄膜分散法

薄膜分散法是目前的脂质体制备工艺中应用最为广泛的方法之一。在制备过程中首先需要将大豆磷脂(SPC)和胆固醇(Chol)按比例混合溶解在适量的乙醇或其他有机溶剂中，制得均匀的混合溶液，再将该溶液减压蒸发除去乙醇，形成脂质薄膜；最后加入盐酸小檗碱缓冲液不断搅拌，即可制得。在实验过程中，需注意将水化温度调至相变温度之上以增加膜的通透性，促使药物分子易于透过磷脂膜而进入脂质体。此外，该法所制得的脂质体为大多层脂质体，粒径较大且不均一，需要使用French挤压法、过膜分散法等技术对粒径进行修饰。薄膜分散法作为应用最早的脂质体制备方法，操作步骤简单，脂质体结构经典，尤其适用于学生实验室进行操作；而且，该方法是逆向蒸发法、pH梯度法等其他脂质体制备方法的基础，只有掌握了薄膜分散法的实验原理及制备工艺才能更好的理解并掌握其他制备方法。但是，采用该法制备也具有一定的缺陷，即所制得的脂质体包封率较低，载药量也较小，不适用于工业化生产。

2 逆向蒸发法

逆相蒸发法是一种将脂类材料溶于有机溶剂(如乙醇、二氯甲烷)中，然后将其与含药缓冲液混合乳化，最后蒸去有机溶剂从而制得所需脂质体的方法。在制备过程中先按薄膜分散法制得脂质薄膜，加入适量乙醚溶解脂质膜，再加入盐酸小檗碱缓冲液形成两相系统，超声形成稳定的W/O型乳化剂，然后减压蒸去乙醚，制得盐酸小檗碱脂质体。在此实验中需要用到旋转蒸发器、超声波清洗器等仪器，学生应熟练掌握所需仪器的使用原理及方法，以减少实验误差，提高成功率。如旋转蒸发器的使用原理是保持装置内真空并恒温加热，同时转动旋转瓶，使其内壁形成薄膜，从而加快蒸发。同时需注意在减压蒸发除溶剂的过程中，装置内易产生大量气泡，因此，必须保持适宜的真空度以免脂质丢失。与薄膜分散法相比，该法所得脂质体的载药量和包封率均较高，但此法也具有一定的缺陷，即制备过程中需要大量使用有机溶剂，极易造成有机溶剂残留[4]。

3 溶剂注入法

溶剂注入法在脂质体的制备过程中也较为常用，其中应用最为广泛的是乙醇注入法和乙醚注入法。乙醇注入法是将脂类材料混合溶于乙醇中，再于60 ℃左右温度下边搅拌边将混合溶液(溶液若不澄清，需滤去杂质后再进行操作)滴入盐酸小檗碱缓冲液中，蒸去有机溶剂乙醇，继续搅拌1～2 h，将所得脂质体依次通过0.8、0.45、0.22 μm微孔滤膜，即得。乙醇注入法是将乙醇换成乙醚，其余同乙醇注入法。在制备过程中，同样需注意仪器的使用问题，合理操作，才能制得高质量脂质体。溶剂注入法的优点在于所制得脂质体形状更为完整，且粒径小于1 μm，适合于制备注射液；缺点是制得脂质体粒径大小不均一[5]。

4 pH梯度法

pH梯度法属于主动载药，在目前的脂质体制备工艺中应用较为广泛，适用于制备两亲性药物脂质体[6]。实验室制备过程为：称取处方量SPC和Chol溶于适量乙醚中，加入枸橼酸缓冲液继续搅拌，乳化，挥尽乙醚，形成乳状液，得空白脂质体，将空白脂质体经微孔滤膜整粒。再按处方量将空白脂质体、盐酸小檗碱缓冲液、NaHCO3溶液于振摇下依次加入西林瓶中，混匀，盖塞，水浴(70 ℃)孵化20 min后，立刻将温度降至室温，即得。在采用此法进行实验时，学生需理解NaHCO3溶液再脂质体制备中发挥的主要作用，即调节脂质体外部pH值，使其保持弱碱性，而脂质体内部为弱酸性，从而形成跨膜pH梯度，盐酸小檗碱在膜外呈分子型，膜内质子化，促使其易于顺梯度进入脂质体内且不易外漏。此外，在制备过程中需确保加药顺序不能颠倒，且需边加边振摇，否则无法获得合格的脂质体。该制备方法的优势在于包封率高、渗透小；缺陷在于产品质量受脂质体粒径、磷脂种类、药物与脂质体的混合顺序等因素影响较大，且重现性也较差[7]。

5 硫酸铵梯度法

硫酸铵梯度法是一种常用的脂质体制备方法，它可在脂质体膜两侧形成跨膜梯度并促使外部药物自发进入脂质体内[8]。该方法一般适用于包载弱碱性药物，而盐酸小檗碱属于强酸弱碱盐，因此可采用此法制备盐酸小檗碱脂质体。制备过程[9]为：精密称量处方量的SPC和Chol混合，加入叔丁醇并加温至45 ℃使之溶解，再加入一定量的硫酸铵溶液超声至形成稳定的W/O型乳化剂，后减压蒸去有机溶剂，再次加入一定量硫酸铵溶液蒸发制得空白脂质体(脂质体内部为硫酸铵)，用5%葡萄糖溶液透析后，将其依次通过0.45、0.2、0.1 μm的微孔滤膜，然后加入盐酸小檗碱缓冲液水浴孵化，即可制得。硫酸铵水溶液近中性，该方法相较于pH梯度法的优势在于可减少磷脂分子的水解，从而确保脂质体的质量和安全性；但缺陷在于所制得脂质体的包封率较低。在此实验中，学生除需掌握旋转蒸发器和微孔滤膜过滤器的原理及使用方法外，还需了解采用5%葡萄糖溶液透析的缘由，即除去膜外部的硫酸铵，从而使膜内外形成硫酸根离子梯度，促使药物自发顺梯度进入脂质体内。

6 薄膜分散-pH梯度法

薄膜分散法为经典的脂质体制备方法，将其与pH梯度法结合可有效改善制得脂质体包封率低的缺陷，提高生物利用度。制备过程[10]如下：称取处方量SPC、Chol与VE混合，溶于适量无水乙醇中，水浴加热溶解，减压蒸发，制成薄膜。加入一定量柠檬酸缓冲液，水化得空白脂质体。再将其经0.8、0.45、0.22 μm微孔滤膜整粒后与盐酸小檗碱溶液混合。用NaHCO3调节外水相pH，水浴孵化，即得。在此制备方法中，需要学生熟练掌握两种方法的制备流程及操作要点，对该操作进行可行性分析，以期将两种方法合理运用，从而制备出高质量脂质体。该工艺将两种制备方法结合在一起，既强化了各自的优势，又补足了各自的短板，使所制得的脂质体拥有较高包封率的同时，制备工艺简便易行、重复性也较好；但此工艺存在一个缺陷，即有机溶剂使用量大，因此不宜用于工业化生产[11]。该方法也为我们提供了一个新的脂质体制备思路，无论是在脂质体的制备还是在其他实验中，学生应学会触类旁通，灵活运用所学知识，在前人的研究基础上继续探索，找寻更优的实验途径，制备高质量产物。

7 超临界CO2法

超临界法制备脂质体是一种在制备过程中将氯仿、乙醚等有机溶剂用超临界流体替代用以制备脂质体的新型制备方法[12]。超临界流体(SCF)即温度及压力均超过其临界状态的流体。与传统流体相比，它具有气体与液体的双重性质和优势，密度和溶解能力与液体溶剂相近，黏度与气体相近，扩散系数介于液体和气体之间，使SCF具有很大的可操作性，其中超临界CO2因具有较低的临界温度和临界压力，同时兼具环保、无毒、廉价、安全等优点而被广泛使用[13]。采用该方法制备时需先称取一定配比(3:1)的SPC与Chol于无水乙醇中溶解，再将该混合溶液与盐酸小檗碱缓冲液于超声下混匀，再将其置于超临界设备中，通入CO2并升压，使其达到超临界状态，孵育后恒速泄压，即得产物[14]。该方法可显著提高盐酸小檗碱脂质体的包封率，增大载药量，同时可最大程度降低有机溶剂使用量，增加生物安全性[15]。在此实验过程中需用到超临界流体设备、恒温磁力搅拌器及电子天平等仪器，掌握这些仪器的操作方法及要点有助于我们更好的进行实验，提高实验成功率。此外，该方法作为一种新型的脂质体制备方法，需要学生对该方法进行更加深入的了解，掌握更多相关知识，以期为今后的学习和研究提供参考。

8 结 语

盐酸小檗碱脂质体的制备方法较多，每种方法各有优劣，在其原理、操作性、包封率、安全性等方面也有所不同，制得的脂质体质量存在较大差异，因此在实验教学过程中，应根据实验条件和实验目的选用合适的制备方法。此外，掌握盐酸小檗碱脂质体的制备方法还可对其他脂质体的制备提供参考。我校在本科药剂学实验教学中，结合实验教学的学时安排，脂质体制备选用了经典的薄膜分散法，该法操作步骤简单，通过该实验的开展，即能锻炼学生实验动手能力，又能通过实验对脂质体的理论知识进一步巩固。