外伤脱位牙保存介质及温度对人牙周膜细胞活性和增殖能力的影响

聂述琳，朱锋 ,孟翔峰，聂蓉蓉

[南京大学医学院附属口腔医院(南京市口腔医院) 1.修复科，2. 颌面外科，江苏 南京 210008]

外伤脱位牙是指牙齿因为外伤从牙槽骨中完全脱出，是最严重的牙病之一。牙脱位造成神经血管供应受损，人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts, hPDLFs)丧失和牙髓坏死[1]。即刻牙再植被认为是一种有效的治疗外伤脱位牙的方法，但这往往难以做到，牙再植术成功的关键是术前最大限度保存牙根表面hPDLFs活力。如果牙根表面hPDLFs数量较少，再植后则会导致牙周膜愈合不良，发生骨性粘连或牙根外吸收。因此学者们建议，如果不能立即行脱位牙再植术，则应将撕脱的牙齿保存在适当的培养基中以保持生存能力，特别是细胞增殖能力[2-3]。

本研究旨在通过体外细胞培养模拟牙脱位保存模型，研究不同保存介质和保存温度对hPDLFs活性和增殖能力的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和鉴定

本研究经南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会审核通过，编号2014NL-025(KS)。

选择南京大学医学院附属口腔医院颌面外科门诊因正畸需拔除的青少年的健康双尖牙进行牙周膜细胞原代培养。细胞培养采用DMEM培养液，含10%胎牛血清(Gibco)、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、100 IU·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素(Invitrogen)。培养瓶置于37 ℃恒温孵箱中静置培养，培养条件为5%CO2、100%湿度。

细胞培养至第4代进行角蛋白和波形丝蛋白染色鉴定，0.3% Triton X-100 (Sigma)对细胞作用5 min后用5%牛血清白蛋白(Sigma)封闭1 h。样品洗涤后，在37 ℃下用荧光标记的二抗(Invitrogen)孵育1 h，细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) (Sigma)染色。图像由共聚焦荧光显微镜(Olympus)拍摄。

1.2 实验方法

将第5代细胞消化后调整细胞密度为1×105个·ml-1，96孔板(Thermo Fisher Scientific)每孔接种100 μl 细胞悬液，37 ℃、5%CO2培养。待细胞生长融合到80%左右时去除原培养基，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗两遍后分别加入PBS、全脂牛奶(光明)、唾液和纯净水4种保存介质，每组100 μl，其中加入PBS的为对照组，其余3种为实验组。唾液采用0.22 μm除菌过滤器过滤灭菌。选择两个实验条件(4 ℃和室温)，放置1 h，然后去除对照组及实验组细胞培养液，PBS漂洗两遍。

1.2.1 5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷 (5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)实验 漂洗后每孔加入含10 μmol·L-1EdU的DMEM培养基, 继续培养4 h后收集细胞；多聚甲醛固定后加入含Alexa FluorTM488荧光染料的EdU反应液，室温孵育30 min；PBS漂洗细胞后采用DAPI染料染色细胞核，甘油封片后采用激光共聚焦显微镜观察具有绿色荧光的细胞密度。

1.2.2 细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)实验 漂洗后每孔重新加入DMEM培养基100 μl，孵育24 h后弃除原培养基，PBS漂洗3遍后分别加入含10%CCK-8(Dojindo Laboratories)的DMEM培养基100 μl，放置培养箱中保存2 h后，使用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值(OD值)，对细胞活力进行检测。同时为了分析不同保存介质对hPDLFs生长状态的影响，我们按照上述方法连续检测24、48和72 h的OD值，观察细胞生长曲线。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件包对实验数据进行统计分析，相同温度下不同保存介质之间采用Kruskal-Wallis检验，同种保存介质不同温度条件之间采用Mann-Whitney检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 人牙周膜细胞鉴定

对分离纯化后的第4代细胞进行免疫荧光鉴定结果(图1)显示：该细胞表达波形蛋白(图1C)，不表达角蛋白(图1B)，符合hPDLFs特征。

图1 人牙周膜细胞的鉴定

2.2 EdU实验

EdU实验显示：在相同的保存温度下，牛奶处理hPDLFs 1 h后，EdU阳性细胞(绿色)约占总细胞的50.9%(4 ℃)和41%(室温)，表达差异具有统计学意义(P=0.007)；采用唾液处理hPDLFs 1 h后，EdU阳性细胞(绿色)约占总细胞的36.56%(4 ℃)和27.33%(室温)，表达差异具有统计学意义(P=0.008)；当采用纯净水处理细胞后，细胞大量死亡，存活数量极少(图2)。当选择相同的保存介质时，细胞保存在4 ℃环境下EdU阳性细胞明显多于室温保存的细胞。上述结果提示，细胞保存于牛奶和低温环境中更有利于维持其增殖活性。

a、b、c、d相同字母间比较，P>0.05；不同字母间比较，P<0.05

2.3 细胞活力检测

为了明确不同保存介质和温度对hPDLFs 细胞活力的影响，采用CCK-8检测发现，不同的保存介质干预hPDLFs 1 h后，以PBS 4 ℃为对照组基数(100%)，4 ℃下牛奶、唾液、纯净水中hPDLFs活力依次约为62.8%、17.8%、3.3%，室温下则依次为56.2%、15.2%、0.7%(图3)，不同处理组间CCK-8检测OD值差异均具有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示，细胞保存于牛奶和低温环境中更有利于维持其活力。

a、b、c、d相同字母间比较，P>0.05；不同字母间比较，P<0.05

2.4 细胞生长曲线

为了进一步探讨不同保存介质对细胞生长的影响，hPDLFs经过不同保存介质和温度预处理1 h后更换完全培养基，于培养箱中继续培养24、48、72 h。CCK-8检测显示，细胞保存于4 ℃牛奶中的生长曲线最接近于正常对照，而保存于唾液和纯净水中的细胞生长缓慢，与牛奶保存相比，细胞增殖速率差异具有统计学意义。在室温条件保存，细胞虽然在48 h表现出与4 ℃组类似的增殖活性，但是在72 h 时，牛奶组的增殖活性低于4 ℃组，唾液和纯净水则出现了增殖迟缓甚至减少的趋势(图4)。上述结果表明，细胞保存于牛奶和低温环境中更有利于维持其原有的生长状态。

a、b、c、d相同字母间比较，P>0.05；不同字母间比较，P<0.05

3 讨 论

3.1 暴露时间和实验方法的选择

如何为外伤脱位牙找到最合适的存储介质，是口腔创伤医学面临的挑战。在以往的研究中，各种类型的存储介质在体外维持hPDLFs生存能力的有效性，主要是将存储介质作为培养基作用在培养的hPDLFs上进行测试，或将提取的牙齿直接浸入测试介质中，然后对活细胞进行定量[4-5]。本研究选择的是前者，也就是在细胞培养的基础上使用不同的存储液，主要是考虑充足的细胞量能够保证实验条件的一致性。本研究选取的暴露时间也就是脱位牙需要使用存储介质的时间是1 h，因为一般情况下，牙齿脱位后患者基本能在1 h左右赶往医院急诊进行再植手术，所以我们的研究方案是将牙根表面牙周膜细胞先在储存介质中保存1 h，然后检测更换为正常培养基后24、48、72 h细胞的活力和增殖能力，以此模拟脱位牙再植后牙根表面牙周膜细胞的一个生存状态。

3.2 保存介质的影响

已经有很多研究就牛奶、橄榄油、蜂胶、椰子水、Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)及多种培养基作为脱位牙保存介质，对hPDLF增殖活力的影响进行过研究，尽管多数认为HBSS是一种最适合用作外伤脱位牙保存的媒介，但在日常生活中难以即刻获得[6]。本研究主要从保存液获取的难易程度上考虑，选择了民众最容易立即得到的牛奶、唾液、纯净水3种保存液。从研究结果我们看到，以牛奶作为培养介质的hPDLFs，细胞活性最好，48和72 h细胞持续增长。本研究结果也符合美国牙髓病学协会建议将牛奶作为脱位牙保存介质的指导意见。

牛奶作为储存介质的有效性可能是其具有适宜的生理pH值和渗透压，同时牛奶里含有一些营养成分和生长因子如表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor，IGF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)，这些都能促使细胞更好地增殖[7]。唾液是一种生理保存液，尤其是在牙外伤时，因环境条件等限制，它可认为是保存脱位牙方便而快捷的介质。因为唾液的渗透压较低且存有细菌，所以进行牙再植术前，应用生理盐水将脱位牙根面因外伤所致的细胞溶解物、残渣和唾液中的细菌洗净，以保证再植牙的成功[8]。纯净水是一种易于获得的保存介质，但是由于纯净水的pH值、低渗透压可以导致细胞裂解，它在一定程度上可以作为阴性对照[9-10]。

3.3 温度的影响

温度对贮藏溶液维持细胞增殖能力的影响也需要进一步研究。系统性评价发现，大部分的实验结果中，4 ℃时hPDLFs的活力比20 ℃时更高，这些保存介质包括了牛奶、椰汁、蜂胶、蛋清、水；但HBSS却相反，研究结果显示，20 ℃保存条件下hPDLFs的活力更好[5]。也有研究认为，只要hPDLFs储存在合适的培养基如HBSS、DMEM或牛奶中，温度起的作用很小[11-12]。然而本研究的结果与Sigalas等[13]的发现相同，细胞在4 ℃ 的低温作用下，虽然对后期增殖能力有所影响，但48、72 h后其增殖能力是逐渐恢复的。所以我们认为低温介质更适合于保护hPDLFs的增殖能力。

虽然本研究结果认为低温牛奶是保存外伤脱位牙最为方便有效的保存介质，但值得注意的是实验室研究和真正临床病例的差异性，我们还需要结合更多的其他细胞代谢测定方法，才能得出最终的结论。