石油污染土壤的微生物修复研究进展*

胡永扬，刘沙沙，翁丹宜，陈显宇，张洁莹

(肇庆学院环境与化学工程学院，广东 肇庆 526061)

随着经济的迅猛发展，有着“黑色黄金”美称的石油已经逐渐成为了当今世界必不可少的能源，被广泛的应用于各行各业，关系着我国国民经济的发展[1]。但由于技术水平等多种原因受限，在石油开采、运输、加工当中，会不可避免的发生泄漏，一旦石油泄漏到环境之中，会给环境造成巨大的危害。当石油进入土壤环境中时，会造成土壤的理化性质及结构组成方面发生改变，进而直接或间接地影响农作物的生理过程[2]，而且石油烃类中含有某些致癌物质还可通过食物链的富集作用进入人体，危害人类健康，因而修复石油受污土壤变得刻不容缓。

单独依靠土壤本身的自然修复是十分缓慢的，修复周期长，修复效果也不尽人意[3]。所以目前可以依靠的修复方法有物理修复、化学修复、生物修复及联合修复等四种[4]。在早期的修复中多采用物理及化学方法，虽然具有周期短、见效快的特点，但大多都具有对环境造成二次污染，成本高昂等弊端[5]。而相比于物理修复、化学修复而言，生物修复具有成本低、无二次污染、不破坏土壤环境、处理效果好等特点[6]，凭借这些优异的特性，生物修复逐渐成为研究热点。微生物修复法则是整个生物修复中最重要的组成，微生物能将石油烃类有机污染物作为自身生长繁殖的碳源，在降低石油烃类污染物的含量的同时，产生新的降解菌，最终将土壤中的石油烃含量下降到不至于危害环境的可接受地步或是彻底转化为无毒无害的物质[7]。由此可见，微生物修复技术是一种符合绿色发展的修复方式，并且逐渐成为近几年在此方面的发展重点，备受青睐。本文总结和梳理了微生物处理技术以及影响微生物修复的因素等方面内容，并展望了该领域的研究进展。

1 环境中降解石油的微生物

微生物具有种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异的特点，并且其内具有的降解酶体系可通过氧化还原、脱羧、脱氨、水解、脱水等各种化学作用来更高效的降解石油以及利用物质能量，因此微生物治理环境污染成为了当前研究的热点。在自然中可以降解石油烃类化合物的微生物约有100多个属、200多种，其中包括细菌、放线菌、真菌等微生物均可使石油烃类化合物得到降解，而在土壤治理中发挥着主要作用是细菌和真菌。土壤中常见的细菌降解种群有：假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)和分支杆菌属(Mycobacterium)；其中应用最为广泛的是假单胞菌属，它对烷烃和芳香烃类物质均具有较好的降解效果[8]。常见的真菌降解种群数有：红酵母属(Rhodotorula)、假丝酵母属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)；其中研究最多的是假丝酵母，它对营养要求较低，生长繁殖速度快且具有较高降解效果[9]。

2 微生物修复技术

2.1 生物培养

生物培养法又称为生物刺激法，其菌株来源为土著微生物，是指在石油受污土壤中添加某些微生物生长繁殖所需的营养元素：如N、P等，或是加入氧气或H2O2作为电子受体、表面活性剂等，同时为土著菌群提供适宜的代谢条件[10]。通过以上的方法来提高土著微生物的代谢活性，从而提高土著微生物的降解能力，使得土壤中的有机污染物能被彻底转化为无毒无害的物质。

在长期与石油烃类污染物的接触中，土壤中原本具有一定石油降解能力的微生物成为优势菌种，而其他土著微生物则能逐渐适应环境中的改变，进行有利于自身生存的选择性改变，改变其遗传特性，使后代得以生存。研究表明：在没有受到石油污染的情况下，土壤中仅有1%的菌群可以降解石油中的烃类化合物，但是在长期受到石油污染的环境中，这一比例可以提升到10%[11]。土著微生物的优点能够很好的适应当地环境中的改变，具有巨大的降解潜力，但缺点就是土著微生物的生长速度慢，代谢活力差[12]。因而生物培养法能够刺激土壤中的土著微生物的代谢活力，使其更好更快的降解石油烃类污染物。目前，大部分的生物修复也都是利用土著微生物进行修复，外接微生物在进入土壤环境中难以保持生物活性，且会受到土著微生物的竞争作用，只有在土著微生物无法有效降解微生物的情况下，才会考虑接入外源微生物[13]。

2.2 生物通风

生物通风技术(BV)是在土壤气相抽提技术(SVE)为基础衍生出来的一种原位修复技术。BV实际上是生物增强式SVE技术，通过将SVE和生物降解相结合，通入空气至污染区域，提高降解菌活性，去除土壤中挥发性有机物的一种方法[14]。生物通风技术具有以下优点：对影响环境较少，作为原位修复不需要太大的扰动且设备简便易行，效率较高，无尾气处理，相较于SVE所使用的成本较低。同时该技术也能修复低渗透性、高含水率的土壤；环境副作用小，BV的最终产物是二氧化碳、水和脂肪酸，如果中间产物为污染物，可在出口处安装气体净化装置以避免二次污染[15]，应用范围较宽，既能用于处理挥发组分，也能处理半挥发组分和重组分有机物，且重质组分处理效果更为明显[16]；操作灵活简易，可采取一些强化措施促进微生物的修复效果，如给土壤注入纯氧气、升高土壤温度和在通入空气添加营养物质(N、P)、添加表面活性剂或工程菌等，也可以使用间歇式通风的方式来增强处理效果[17]。生物通风技术是继土壤气相抽提技术后土壤原位修复的又一革新技术，将物理方法与生物处理两种方法相结合，能取得更加高效的处理效果。但是该法也存在一定的局限性，对于在二恶英、杀虫剂和多氯联苯等有机污染物的土壤修复，或黏土含量高，湿度大等土壤通透性差的土壤修复中，就不宜采用[18]。

2.3 固定化微生物技术

固定化微生物技术是指通过物理或化学的方法，将环境中分散、游离的微生物固定在适当的载体中，使其保持一定的生物活性以及提高生物细胞浓度，加快细胞繁殖，并将其反复利用的一种方法[19]。固定化微生物具有以下优点：固定化载体为微生物提供一个良好的环境，抵抗外界的不利条件的影响，如：毒害物，人为干扰，环境因素以及与土著菌种竞争等，使微生物相比于游离状态下具有更高的稳定性和生存能力。不仅如此，高密集的细胞可以长期保持活性，可供反复利用，能有效的降解石油的同时减少成本消耗[20]。近年来，固定化微生物技术广泛应用于废水，污泥，污染土壤的治理，具有很好的发展前景[21-23]。但固定化微生物技术也具有一定的局限性，固定化微生物载体在环境中有着难以回收的问题，这将会给环境带来一定的危害。另外，一些成分复杂的载体材料会对降解石油物质机理的分析带来影响。因此，在今后的研究中探寻合适的、固定化效果好的、对环境友好的载体以及分析载体、微生物与石油物质的相互作用成为目前主要的研究方向。

3 微生物修复石油污染土壤的影响因素

3.1 微生物的种类与菌群的影响

不同种属的微生物对石油烃的降解效果都不同，一般每种微生物只对石油烃中某种特定的成分降解能力较强，如刘俊[24]所研究表明，白腐真菌对多环芳烃菲、蒽和荧蒽降解，在初始pH为5.0、体系温度为30 ℃、菲、蒽和荧蒽分别为10 mg/L，培养15 d，菲、蒽和荧蒽的降解率分别达到95.7%、85.7%和72.9%。而田秀梅等[25]筛选、分离出的一株YQJ-1醋酸钙不动杆菌，在pH为8.0、温度为35 ℃时，对C11～C25的短链烷烃的平均降解率达到87.84%，然而对C26～C37的长链烷烃降解效果并不高。为此改变微生物的种群结构有利于提高石油的降解效果，如李乐等[26]研究表明，由所分离的三株菌株：LD3链球菌属(降解范围：C19～C39)、LD7葡萄球菌属(降解范围：C21～C39)、W6微球菌属(降解范围：C13～C18)，组合成复合菌剂，在温度30 ℃、pH为7.0，其降解率高达92.06%，相比于单菌株降解有更好的效果，避免了单菌株降解范围限制和降解效率低的缺点，充分结合了各菌株降解优势。因此接种复合菌剂，混合的微生物群落和构建微生物菌群，通过其间的生物协同作用，能更加完全的降解石油。

3.2 环境因素对石油生物降解的影响

3.2.1 供氧量

不同种类的微生物对石油烃的分解随着烃类的不同而发生变化，但所有的微生物降解石油烃的起始反应都是相似的，在有氧的条件下，微生物菌群通过协同作用，集合多种酶促反应[27]，催化氧气与基质发生反应，产生一种含氧的中间产物。试验表明[28]，在有氧的条件时，烃类经微生物降解14 d的降解率可达20%，但在厌氧条件下，经过233 d却只能降解不到5%。而且氧气含量是否充足也是成为制约着微生物降解石油烃类污染物的限制条件之一，有氧时降解速率会更快，因此通常要求降解过程中氧气要保持充足，如果分子氧不足就会导致降解过程缺少受氢体，从而影响微生物的正常生长[29]。因此，在微生物修复石油污染土壤时，供氧量也会直接影响微生物的降解速率，在实际的生物修复运用实例中，可通过生物通风法，为微生物提供充分的氧气，以保障正常的生物降解。

3.2.2 石油烃浓度

由于所处实际的污染环境不同，石油污染土壤中的石油烃组成，含量也就各不相同。石油烃浓度的不同将会影响微生物降解石油的速率，过高的石油烃浓度将会对微生物产生毒害作用，阻碍微生物的代谢活性，甚至会造成微生物的死亡，过高的石油浓度也会使N、P等营养的缺乏，不利于微生物的降解[30]。甄丽莎[31]分别设置了5000 mg/kg、10000 mg/kg和50000 mg/kg的三个不同浓度的石油污染土壤来探讨不同石油浓度对微生物修复石油受污土壤的影响，结果表明前21天累计的石油降解率分别为总降解率的91.08%、88.37%和74.67%，说明初始的土壤含油量越高，微生物修复越缓慢。此外，过低的石油浓度会使得微生物缺乏酶的诱导，体内完成反应的机制不适合低浓度污染物的降解，且在不合适的物质供应条件下也会丧失其基本的生存能力[32]，也会成为微生物降解的限制条件之一。在极端的石油烃浓度下，土壤不再适合进行生物修复，需要对土壤进行相应的预处理，使石油烃浓度下降到适合微生物修复的范围，更加利于微生物修复污染土壤，增大降解速率。

3.2.3 营养元素

微生物的代谢离不开营养物质的参与，而微生物修复石油污染的一个重要限制条件也是营养元素。由于石油受污土壤常常含有过高的碳源，从而导致土壤中的营养元素相对缺乏[33]，缺乏N、P等营养元素也将会抑制微生物降解石油烃，直接降低微生物修复土壤的速度，王艳杰等[34]在仅添加营养物质的条件下，经过90 d的修复周期，总石油烃的去除率达到27.44%，显著高于对照组的总石油烃去除率16.15%。此外，还有另一个重要的因素则是营养元素的添加比例，营养元素是否能做到持续供给等都对微生物的降解速度产生明显影响。白云[35]在对其添加的外源菌种黄孢原毛平革菌的营养比例探究中，在四组营养配比的对比中，C:N≤10的两组降解率比C:N≥10的两组降解率高，说明不同的营养配比对微生物的降解率也会有一定的影响。而且有研究表明，在不同的降解时期内，碳氮磷比对石油中各组份的降解速率影响不同。在降解初期，较低的碳氮磷比的降解启动时间短，氮磷的消耗和降解速率较快，而在降解后期，碳氮磷比对降解速率的影响反而不是很明显[36]。所以在实际修复过程中根据环境中的石油污染程度投加适当的微生物所需营养元素，找出适宜微生物降解的营养元素添加比例，会使得降解速度得到明显提高。

3.3 表面活性剂对石油生物降解的影响

表面活性剂是具有亲水基和疏水基且分别能与水相和油相结合，能够显著降低油水界面张力和提高石油烃在溶剂中的溶解度的一类物质[37]。但考虑到环境修复要求修复材料无二次污染的问题，那么生物表面活性剂则因其具有环境兼容性，即无毒、能够被生物完全降解、不对环境造成污染，并且具有选择性好、用量少等优点[38]，在如今的石油烃污染微生物修复中得到了更广泛的应用。当表面活性剂进入土壤后，表面活性剂就会吸附在土壤颗粒表面上，降低土壤表面张力，使水相与土壤固相充分接触。随着浓度的增加，表面活性剂分子会吸附在土壤表面上形成胶束，此时，不溶于水的石油烃类物质通过增溶作用逐渐从土壤中脱离到胶束中，从而促进了石油烃与微生物的接触。并且，生物表面活性剂具有可生物降解性，为降解菌提供营养物质起到生物刺激的作用，协助土著或外源微生物进行修复，进而提高了降解效果[39-41]。Saeki[42]研究表明，利用生物表面活性剂生产的菌株JE1058制剂制成粉剂应用于海洋石油泄漏的生物修复，结果表面其不仅可以大大的促进油污的溶解，同时还可以促进海洋本土菌ANS21对油污的降解。孙雨希等[43]研究表明，通过筛选出的O-1短小芽孢杆菌属与 O-2威尼斯不动杆菌，配制成混合菌O-H修复含油污泥，添加槐糖脂生物表面活性剂，24 d户外修复周期内，石油降解率达到40.1%，较仅有土著菌修复提高了35.0%，异养菌群总数提高了350倍。因此在微生修复过程中，加入生物表面活性剂不仅可促进微生物与石油烃接触，还通过生物刺激的作用，提高了生物的可利用性，从而提高石油降解的效果。

3.4 固定化载体种类对石油生物降解的影响

固定化载体材料的种类有很多，分为四种：无机载体材料、天然有机载体材料、合成高分子材料以及复合载体材料[44]。不同载体材料与降解菌结合成的固定化菌剂，其降解效果各不相同。主要是因为载体材料与微生物之间的协同机理不同：有的载体材料对石油烃的吸附能力较强，使得固定化菌能够与之充分接触，形成吸附-生物降解协同作用，从而提高了降解的效果。如田秀梅等[45]用乙酸改性苎麻纤维固定醋酸钙不动杆菌、鲍曼不动杆菌、威尼斯不动杆菌、红球菌组合成混合菌剂。7 d后与游离菌相比，固定化菌剂对烷烃的降解率为86.08%，其中短链烷烃(C12～C20)降解效果最佳为94.85%，而游离菌仅为67.86%。这是由于乙酸改性苎麻纤维的亲油疏水性，增加了对烷烃吸附，起到了富集效果，而短链烷烃更容易被降解菌摄取，进而提高了短链烃的降解效果。而有的载体材料孔隙率较大，增加了氧气流动，其内布满菌丝，形成生物刺激-生物强化与真菌-细菌协同作用，提高了微生物活性，从而提高降解效果。如张博凡等[46]用菌糠作为固定化载体，固定微杆菌属Q2，修复45 d后，菌糠固定化菌剂降解率可达63.05%，高出游离菌22.05%的降解效果。在富集吸附石油烃物质的同时，还起到了细菌-真菌强化修复的效果。另外，为取得更好的降解效果，应当选择适合的载体材料，如王智[47]所研究表明，在相同的受试菌群YJ01与相同条件下，活性炭与苎麻对石油烃某组分降解效果不同，主要体现为活性炭固定化菌群对石油烃中高碳数烷烃的降解效果较好，降解率可达58.64%，而苎麻固定化菌群对石油烃中中碳数烷烃降解效果较好，降解率可达93.10%。因此，选择合适的载体材料或使用复合载体材料，可提高微生物降解石油的效果。

4 结 语

随着我国石油产业的不断发展，石油的需求量正逐年上升，伴随其产生的石油污染问题也越来越严重。因此，为解决石油污染问题而出现的一种有效手段——微生物修复技术。虽然，微生物修复技术由于其高效，无污染，低成本等优点已得到广泛应用，但目前仍然存在着许多问题。本文探讨了生物培养、生物通风、固定化微生物技术三种修复技术的应用以及几个微生物修复石油污染的影响因素，为提高微生物修复对石油污染的处理效果，以下几个方面还需要我们更进一步研究：

(1)完善工艺技术，优化工艺流程降低成本，运用多种技术联用提高降解效果；

(2)筛选、驯化，并构建降解效果更加好的微生物菌群；

(3)深入研究微生物降解石油烃的机理，根据影响因素合理调控，作为提高降解效果的客观保证；

(4)降低生物表面活性剂的生产成本，以及开发更具经济效益的生物表面活性，从而降低修复成本；

(5)开发更高强度，更具有生物相容性且环境友好的固定化载体材料，使固定化微生技术得到更加广泛的应用；

(6)综合利用各种修复技术，将环境与修复技术相结合，制定合理的治理方针，使石油污染问题达到更科学、更经济、更有效的解决。