气质联用技术在基因毒性杂质检测中的应用进展

陈忆铃，冯 芳,2

(1 中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 210009；2 药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009)

基因毒性杂质是指能直接或间接作用于DNA，从而引起基因突变、染色体断裂或染色体重组的一类杂质，即使暴露于低水平剂量也可能诱发癌症。基因毒性杂质可能作为药物合成过程中的起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物或贮藏运输过程中的降解产物而被引入到终产物中，影响药品的质量，危害患者的身心健康。2006年，EMEA颁布了基因毒性杂质限度指南，引入了毒理学关注阈值(TTC)的概念，推荐TTC为1.5 μg/d，具体含义指一个人终生(70岁)每天摄入1.5 μg基因毒性杂质，其患癌的风险低于十万分之一，对绝大多数药物来说是可接受的风险。基因毒性杂质可接受限度(μg/g)=TTC限度(μg/d)/药物最大日剂量(g/d)[1]。基因毒性杂质反应活性高、稳定性差，这使得药物中此类痕量杂质的分析极具挑战性，要求分析方法具有较高的灵敏度和特异性。气质联用技术结合了气相色谱的高分离效能以及质谱检测器的高选择性高灵敏度，目前已被广泛应用于基因毒性杂质的检测，本文主要介绍了气质联用技术在卤代烷烃、磺酸酯、环氧化物、芳香胺以及肼类化合物等5类常见基因毒性杂质检测中的应用进展。

1 气质联用技术和样本前处理方法的结合

当样品热稳定性较差，严重污染进样口，或在进样口与溶剂反应生成待测物时，不适于直接进样。此时，气质联用技术需与样本前处理方法结合，根据样本和待测物的性质选择不同的前处理方法进行样本中基因毒性杂质的分离检测。可采用合适的萃取技术如液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、液液微萃取(LLE)等对待测物进行提取、分离、富集和浓缩，减少基质干扰的同时提高了检测的灵敏度。此外，还可以通过选择合适的衍生化试剂改善待测物的挥发性或热稳定性，进而提高分离检测效果。

2 气质联用技术在基因毒性杂质检测中的应用

2.1 卤代烷烃

卤代烷烃常作为药物合成中的试剂或由盐酸与醇类试剂的副反应产生。它能够直接与遗传物质DNA发生烷基化反应，是最常见的一类基因毒性杂质。卤代烷烃种类繁多，理化性质差异较大，需要根据其结构特点建立相应的检测方法进行控制。

郑等[2]以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，采用直接进样GC-MS法测定盐酸右美托咪定中氯甲烷和氯乙烷，LOD可达50 ng/mL；Mamilla等[3]以甲醇为溶剂，采用直接进样GC-MS法测定阿替洛尔中氯丙烯，1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇，LOD可达50 ng/mL；Gooty等[4]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法在选择离子监测模式下(SIM)定量测定福多司汀中的3-氯-1-丙醇、1,3-二氯丙烷，一定程度上降低了基质干扰，该方法灵敏准确，3-氯-1-丙醇和1,3-二氯丙烷的LOD分别可达0.08 μg/mL和0.05 μg/mL；García等[5]采用强阴离子交换器固相萃取GC-MS法测定氯苄哌醚联苯酰苯酸盐原料药中的2-氯乙烷，固相萃取技术有效地实现了样本净化，该方法专属强，LOD可达100 μg/L；Reddy等[6]以水/N-甲基-2-吡咯烷酮(80:20)为溶剂，采用HS-GC-MS法测定双丙戊酸钠中的溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、2-溴丙烷及溴丁烷，LOD均可达2.5 ng/mL；叶等[7]以水为溶剂，采用HS-GC-MS法测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中的溴乙烷，同时采用多反应离子监测模式(MRM)进一步提高了检测的选择性和灵敏度，LOD可达14.74 ng/mL；Harigaya等[8]用N,O-双(三甲基硅基)三乙酰胺(BSTFA)为衍生化试剂，3-氯-1-丙醇为内标，采用直接进样GC-MS法测定某原料药中的4-氯-1-正丁醇，该方法灵敏度高，准确度好，LOD可达0.125 ng/mL。

2.2 磺酸酯

磺酸常作为反离子试剂用于碱性药物的成盐反应以提高药物的稳定性、溶解度和生物利用度。磺酸盐类药物合成过程中任何残留醇的存在均可能导致磺酸酯类基因毒性杂质的形成，需要采用合适的分析方法对原料药或药品中可能存在、或未在早期合成过程中清除的磺酸酯进行监测。

Ramakrishna等[9]以正己烷为溶剂，采用直接进样GC-MS法测定甲磺酸伊马替尼中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，LOQ和LOD分别为1.0 μg/mL和0.3 μg/mL。Zhang等[10]以水饱和正己烷为溶剂，采用全扫描模式对甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯进行定性分析确定峰位，随后采用提取离子模式(EIC)定量测定甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯，LOQ和LOD分别为5 ng/mL和1 ng/mL，该方法使用水饱和正己烷，水分的引入，可导致色谱柱固定液流失，柱效下降，这可能是待测物峰形拖尾的原因。样本未经前处理直接进样会导致样本基质在进样口大量沉积，污染进样口，重现性较差。采用萃取技术可在一定程度上降低共存物质的干扰。Wollein等[11]以正己烷为萃取剂提取固体制剂粉末中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯、甲磺酸正丁酯、苯磺酸乙酯和对甲苯磺酸甲酯，该方法灵敏度高，各待测物LOD均可达5 ng/mL，但在运用该方法时需注意可能产生的残留效应。Liu等[12]采用乙酸乙酯液液萃取-GC-MS/MS法测定甲磺酸伊马替尼中的九种磺酸烷基酯类基因毒性杂质，采用MRM模式降低了基质干扰同时提高了检测的灵敏度、专属性，各待测物LOQ均小于0.95 ng/mL；Colon等[13]分别采用固相萃取法(SPE)、固相微萃取法(SPME)、液相微萃取法(LPME)结合GC-MS对不同原料药中限度为50 mg/kg的7种磺酸烷基酯进行检测，相比于液液萃取，微萃取所使用的有机溶剂较少且不易发生乳化，降低样本基质干扰的同时，实现待测物的富集，有利于提高检测的灵敏度。为防止直接进样导致磺酸烷基酯在进样口发生热降解，或原料药中残留的甲磺酸和磺酸盐原料药本身在进样口与醇类溶剂发生酯化反应从而造成假阳性结果的可能，可采用衍生化技术提高磺酸烷基酯的稳定性，同时降低基质干扰，提高检测专属性。Lee等[14]以硫氰酸盐为衍生化试剂，采用HS-GC-MS同时测定样本中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸异丙酯和硫酸二甲酯，各待测物的LOD均可达50 ng/mL，与HS-GC-FID相比灵敏度有很大的提高。Alzaga等[15]以五氟苯硫酚为衍生化试剂，采用HS-GC-MS法测定原料药或中间体中的磺酸烷基酯及烷基硫酸酯，该方法的准确度受到不同基质的干扰，回收率变化较大，因此需采用氘代内标弥补这一不足。EP 9.0通则2.5.38、2.5.40、2.5.41中，均以碘化钠为衍生化试剂，采用HS-GC-MS 法测定原料药中的甲磺酸烷基酯、苯磺酸烷基酯及对甲苯磺酸烷基酯，是一种高专属性、高灵敏的通用检测方法。王等[16]借鉴该方法测定了SIPI5357 甲磺酸盐中3种甲磺酸酯，LOD均小于0.375 ng/mL。

2.3 环氧化物

环氧化物是重要的有机中间体，被广泛应用于药物合成领域。环氧化物的亲电子碳原子能与DNA亲核中心反应，形成烷基化物，药物合成过程中的环氧化物类基因毒性杂质已成为重要关注和控制内容，但环氧化合物在高温下易分解的性质给分析方法的建立带来了巨大的挑战。

Loda等[17]以甲醇为溶剂，采用直接进样GC-MS法测定某一原料药中的环氧氯丙烷，相比于GC-ECD，该法专属性更强，灵敏度更高，可以实现原料药中限度为8 mg/kg的环氧氯丙烷的检测；Chen等[18]采用直接进样GC-MS法检测药物中微量的高沸点环氧化物，通过优化进样口温度降低了基质干扰，提高了SIM的信号响应。刘等[19]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法检测不同水源中的环氧氯丙烷，该方法操作简单，灵敏度和准确度高，重现性好；Sadao等[20]采用固相微萃取技术提取水中的环氧氯丙烷，运用GC-MS进行分析，LOQ可达40 ng/L；刘等[21]以正己烷为萃取溶剂，采用液相微萃取技术富集茶叶纸袋中残留的环氧氯丙烷，并以GC-MS进行检测，方法的定量检出限为0.18 μg/mL。以上三种萃取技术均可为药品中环氧化物杂质检测提供参考。Karthikeyan等[22]采用HS-GC-FID测定盐酸司维拉姆中的环氧氯丙烷，同时采用HS-GC-MS法进一步验证了方法的专属性和特异性；Sung等[23]以环戊酮和硼三氟二乙醚为衍生剂，采用GC/MS-SIM模式对衍生化产物进行了分析，为准确测定环氧乙烷的含量，采用1,2-环氧乙烷为内标。结果表明，该方法比现行的CEN法测定食品接触材料中环氧乙烷的残留量更为简便有效。

2.4 芳香胺

芳香胺类化合物是药物合成过程中常用的原料，其本身无毒，但其经体内代谢生成的氮正离子能与DNA发生反应，导致基因突变。根据芳香胺类杂质极性和弱碱性的差异，建立相应的方法对其进行控制。

李等[24]以甲醇为溶剂，采用直接进样GC-MS/MS法在MRM模式下定量测定吉非替尼中3,4-二氯苯胺，LOD可达4 ng/mL；范等[25]采用二氯甲烷液液萃取GC-MS法测定托拉塞米原料中的邻硝基甲苯、邻甲苯胺、对甲苯胺、间甲苯胺，LOD均可达10.25 ng/mL；Muller等[26]采用SPME-GC-MS法测定水中的6种苯胺衍生物，该方法简便快速，灵敏度高，精密度好；Zimmermann等[27]通过重氮化和碘化反应降低极性芳香胺的极性，以固相微萃取技术提取碘代苯衍生化产物，运用GC-MS法分析，该方法灵敏度高，除2-氨基-4,6-二硝基甲苯、4-氨基-2,6-二硝基甲苯和2,4-二氨基-6-硝基甲苯外其余15中芳香胺的LOD均小于13 ng/L；Diao等[28]以乙醇为分散剂，环己烷为萃取剂，采用分散液液微萃取技术提取水中的14种芳香胺，该方法简单、快速灵敏，各待测物LOD均在0.07～0.29 μg/L；Schmidt等[29]采用SPE技术富集水中的芳香胺，以碘或溴为衍生化试剂，生成碘代或溴代产物，采用GC-MS法进行分析，该方法灵敏度高，选择性好；马等[30]通过盐析作用降低氯代苯胺类化合物在水中的溶解度，采用HS-GC-MS法测定水中的11种氯代苯胺，检出限均低于0.3 μg/mL。以上关于水中芳香胺的检测方法均可作为药物中该类杂质检测的借鉴。

2.5 肼类化合物

肼类化合物常作为药物合成过程中的绿色还原剂，反应生成的副产物只有氮气和水，被广泛应用于药物合成。肼类化合物经代谢转化形成的碳正离子和碳自由基可与DNA发生烷基化反应。肼类化合物碱性较强，易与固定液上的硅氧基发生相互作用引起固定液流失影响柱效，这给此类杂质分析方法的建立带来了很大的难度，目前一般采用衍生化方法测定肼类化合物。

牛等[31]以甲醇为溶剂，采用直接进样GC-MS法测定富马酸卢帕他定中痕量杂质偶氮二异丁腈，该方法操作简便，结果准确，灵敏度高，LOD可达0.045 μg/mL；Cathum等[32]分别以4-硝基苯甲醛，4-氯苯甲醛和4-氰基苯甲醛等芳香醛为衍生化试剂，以二氯甲烷提取衍生化产物，采用GC-MS法测定水中的偏二甲肼；Gionfriddo等[33]以氯甲酸丙酯和吡啶为衍生化试剂，采用SPME技术富集衍生化产物，再采用SRM模式进行检测，专属性和灵敏度得到了很大的提升，LOQ和LOD分别可达8.3 ng/mL和4.4 ng/mL；Oh等[34]以1,1,1-三氟-2,4-戊二酮为衍生化试剂，与肼反应生成3-甲基-5-(三氟甲基)吡唑，结合HS-SPME-GC-MS/MS测定水中的痕量肼，LOD可达2 ng/mL。以上水中肼检测方法可为药物中肼检测方法的建立提供参考。Sun等[35]采用丙酮或氘代丙酮为衍生化试剂，将肼衍生化为丙酮嗪，采用HS-GC-MS法进行测定，该方法可用于原料药中痕量肼的检测，降低基质干扰的同时提高了检测的灵敏度，LOD可达10 ng/mL。

3 结 语

药物中痕量基因毒性杂质的检测要求分析方法具有较高的灵敏度、选择性，气质联用技术可实现样本中待测物准确快速的分析。基因毒性杂质结构种类繁多，理化性质各不相同，需要根据药物基质和待物成分的性质选择合适的样本前处理方法，例如采用LLE、SPE、SPME和LPME等萃取技术对样品进行分离纯化和富集后进样分析，该方法能较大程度上减少样本中其他成分的干扰，实现净化样本的目的；或采用衍生化的方法降低待测成分的反应活性，提高其检测特性和稳定性。本文介绍了气质联用技术结合不同的样本前处理方法在5种基因毒性杂质--卤代烷烃、磺酸酯、环氧化物、芳香胺和肼类化合物检测中的应用，降低基质干扰的同时提高检测的灵敏度，可为基因毒性杂质检测方法的建立提供重要参考。