重组杆状病毒载体在基因治疗中的应用*

廖致红,代小丽，吴春凤，刘志华，李丽敏，徐 鹏 综述，沈开元审校

(广西壮族自治区柳州市人民医院检验科,广西柳州 545006)

基因治疗指利用基因转移技术将外源正常基因导入靶细胞，使外源基因的产物补偿基因缺陷或纠正基因异常，从而治疗疾病的方法。外源基因导入靶细胞的方法有很多，基因治疗载体的研究从反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等病毒载体发展到如今的人工染色体载体、细菌载体、杆状病毒等新的载体。但是实现外源基因长期稳定的表达、靶向性的表达还需进行更多的探索和研究[1]。本文对近年来重组杆状病毒基因治疗载体的研究以及其在癌症基因治疗中的应用进行总结。

1 重组杆状病毒及其表达系统

杆状病毒是一种环状、闭合双链DNA病毒，基因组大小为80～160 kb[2]，编码90～180个蛋白，在已测序的杆状病毒中发现31个核心基因[3]。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征，杆状病毒分为核多角体病毒属(NPV)和颗粒病毒属(GV)[4]。

重组杆状病毒表达系统是一种利用杆状病毒为载体，在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。重组杆状病毒表达系统由转移载体、亲本病毒和重组介质3个部分组成，重组病毒的构建过程如下：将目的基因克隆到转移载体，将载体与亲本病毒同时导入宿主细胞，目的基因通过同源重组替换杆状病毒非必需片段形成重组病毒，病毒在宿主细胞内大量复制时，目的基因也得到表达[2]。该技术是一项成熟、安全、经济、高效的蛋白质表达技术。

2 重组杆状病毒在癌症基因治疗中的应用

根据治疗基因进入癌细胞后的不同效应，将重组杆状病毒介导的癌症基因治疗方法分为3种。第一种方法是治疗基因进入癌细胞能够加强机体对恶性增生癌细胞的免疫应答，并清除癌细胞。其方法就是利用重组杆状病毒将癌细胞特异性抗原导入机体，随后激活机体自身的T淋巴细胞的识别作用，进而清除癌细胞[5]。有研究者利用动物模型，通过重组杆状病毒携带CD40配体和白细胞介素(IL)-15基因治疗膀胱癌，发现两种基因的导入可以显著增加膀胱组织单核细胞，CD4+、CD8+和γδ T淋巴细胞的浸润性，明显延长动物的生存期(治疗组>12个月，对照组<2个月)，且端粒反转录酶基因在癌细胞和正常细胞中的表达差异有统计学意义(P<0.05)[6]。据此KIM等[7]构建了包含端粒反转录酶基因的重组杆状病毒载体，并以高剂量接种被植入胶质瘤瘤体的小鼠，随后在实验组小鼠的体内观察到大量分泌干扰素(IFN)-γ的T淋巴细胞，而且实验组小鼠自然杀伤(NK)细胞的活性也显著高于对照组小鼠。重组杆状病毒中载入IFN-β基因后转导Lewis肺癌(LL)细胞可导致体外恶性表型减少，抑制上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达[8]。美国食品药物监督管理局(FDA)在2009年批准的Cervarix疫苗也是利用重组杆状病毒表达系统生产的携带人乳头瘤病毒(HPV)16、18型L1蛋白的病毒样颗粒[9]。这些研究结果表明，重组杆状病毒能够携带病毒抗原蛋白或肿瘤特异性蛋白基因，并在哺乳动物细胞成功表达，激活机体自身的免疫系统来消灭病毒或清除癌细胞。

第二种是将“自杀基因”导入癌细胞，以此实现治疗癌症的目的。WANG等[10]利用神经胶质细胞特异性启动子在胶质瘤细胞中表达白喉毒素A，联合胞内注射可以实现较高的治疗有效率(96%)。利用重组杆状病毒载体表达单纯疱疹病毒胸苷激酶，其可在抗疱疹病毒药物更昔洛韦存在的情况下，诱导恶性胶质瘤细胞死亡，从而达到治疗恶性胶质瘤的目的[11]。

第三种方法是将正常基因导入癌细胞中，以此来纠正癌基因或修复抑癌基因，阻止癌细胞增殖，并诱导其死亡。2001年SONG等[12]运用重组杆状病毒携带人p53基因治疗骨肉瘤，重新导入p53基因的细胞对化疗药物更敏感，因此联合阿霉素，其治疗有效率(95%)显著高于单独使用阿霉素(55%)，这种联合治疗方法为临床应用打下了良好的基础。随后一些组蛋白乙酰化酶抑制剂，例如丁酸钠、曲古抑菌素A、丙戊酸等也被用作重组杆状病毒携带p53基因的联合治疗药物。另一种抑癌基因——正常上皮细胞特异性因子1也在重组杆状病毒表达系统的作用下显著抑制胃癌细胞的增殖，瘤内注射后有效率可达42.3%[13]。Apoptin蛋白是一种能够诱导凋亡的蛋白，且特异性地存在于恶性增生的癌细胞中。将Apoptin基因连入杆状病毒载体后导入机体，只有癌细胞发生凋亡，正常细胞并不受影响，且瘤内注射该重组载体能够显著缩小肝癌细胞的体积[14]。Rta蛋白是EB病毒由潜伏期转向裂解期的关键性调控因子，其与杆状病毒构成的重组杆状病毒能显著抑制鼻咽癌细胞的增殖[15]。另外，将靶向的短发夹RNA利用重组杆状病毒导入癌细胞是另一种具有应用前景的基因治疗方法[16]。

3 杆状病毒作为基因治疗载体的优势

作为基因治疗过程中运输治疗基因的工具，目前常用的转移基因的方法分为非病毒载体系统和病毒载体系统[17]。非病毒载体系统具有毒性小、安全性高、外源基因长度不受限制的优点，但由于人体生理屏障和载体本身的特性，其较低的感染效率和更短的目的基因持续表达时间限制了临床应用。

临床基因治疗使用的病毒载体主要来源于反转录病毒(RV)、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等，但均具有明显的缺陷。相比而言，杆状病毒作为真核生物表达载体，其在携带治疗基因、表达外源蛋白方面的优势表现在以下几个方面：(1)杆状病毒具有很高的宿主特异性，专一寄生于无脊椎动物，对于人体来说，安全性高于上述病毒载体；(2)杆状病毒载体容量大，且多启动子技术可使载体能够同时表达多种蛋白[18]；(3)杆状病毒基因组中的ph/p10基因具有强启动子，可用于完成目的基因的高效转录[19]；(4)昆虫细胞可对外源蛋白进行翻译后修饰，保证了蛋白的生物活性[20]；(5)杆状病毒不会在哺乳动物细胞中复制，也不在这类细胞中增殖和扩散，故不会刺激哺乳动物产生强烈的免疫应答[3]。基于上述优点，杆状病毒载体在基因治疗方面具有良好的应用前景。

4 重组杆状病毒在基因靶向治疗中面临的问题

重组杆状病毒携带的治疗基因在哺乳动物细胞中能否高效表达，是其临床应用面临的一项巨大挑战。杆状病毒不能在哺乳动物细胞中复制，但在某些哺乳动物细胞内，在活性的启动子控制下，外源目的基因能够被高效转录和稳定表达。这一特性为杆状病毒应用于哺乳动物创造了条件，HOFMANN等[21]在1995年利用了重组AcNPV为载体，在CMV启动子作用下，使外源基因在肝细胞中得以表达。另外，重组杆状病毒载体的表面修饰也是提高外源基因作用效应的方法，将RGD肽与杆状病毒的囊膜糖蛋白GP64融合，可以大大提高载体的转导效率[22]。同样，将水疱性口炎病毒膜蛋白G连入重组载体，也能在体内外试验中提高重组杆状病毒表达系统的转导效率[23]。MKEL等[24]将LyP-1、F3以及CGKRK肿瘤靶多肽分别载入杆状病毒表达系统，导入人乳腺癌细胞和肝癌细胞后，发现这些经过表面修饰载体的效率高于未修饰载体的2～5倍。

另一限制重组杆状病毒体内转导效率的因素为该病毒对体内补体反应的不耐受性。重组杆状病毒作为一个病毒载体，能够激活机体的补体系统，导致病毒不能发挥作用，且无法裂解癌细胞，这大大降低了该病毒的作用效果。为了规避体内补体反应，将人衰变加速因子与GP64蛋白融合，可使重组杆状病毒载体具有抗补体作用，并且不干扰病毒的复制[25]。

除了上文提到的提高载体转导效率、规避补体系统反应等问题，重组杆状病毒对相应癌细胞的靶向性也是在投入临床使用之前必须解决的问题。寻求更多具有组织特异性表达的启动子和microRNA是推广这一技术的根本所在，这需要科研工作者付出更多的努力。

5 重组杆状病毒在基因治疗领域的应用前景

自人类于20世纪80年代利用杆状病毒表达系统表达人干扰素后，经过三十多年的发展，杆状病毒表达系统已经与大肠杆菌、酵母等表达系统齐名，广泛应用于基础研究、基因治疗、疫苗制备、单克隆抗体生产以及生物防治等多个领域。2004年4月由我国自主研发的重组人p53腺病毒注射液获得国家食品药品监督管理局批准上市并正式应用于临床，这意味着利用基因治疗恶性肿瘤成为可能。重组杆状病毒为生物技术广泛应用的一种有力载体，尽管其在基因治疗过程中存在各种各样的问题，但是其具有的携带DNA容量大、可操作性好、可同时表达多个外源基因等优点，使其充当的基因传递系统这一角色具有不可替代的作用，今后将有更多有效的治疗基因会通过重组杆状病毒实现其临床应用。