皂角苷对铜绿假单胞菌降解土壤PAHs的影响

杨 伦，吴智勇，陈灵泽，胡凯璐，孙超男，张 栋

(杭州电子科技大学 材料与环境工程学院 环境科学与工程系，浙江 杭州 310018)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)具长期污染、生物蓄积及“三致”效应，1976年美国环保署率先将16种PAHs列为优先控制污染物，也是我国优先控制的68 种污染物之一。PAHs污染土壤会导致土壤功能受损，危害人和生态安全，急需有效修复[1]。微生物修复因成本低、效果好、二次污染少等优点备受关注[2]，但PAHs生物有效性低，限制了微生物修复的应用[3-4]。生物添加和增效试剂强化是提高微生物修复效率和程度的有效途径[5-6]，但目前其作用机制、界面过程调控及其联合作用，均尚不清楚。因此，本文以铜绿假单胞菌和皂角苷为降解菌和表面活性剂代表，研究了铜绿假单胞菌对PAHs的降解和吸附性能，探明了皂角苷对土著微生物降解和铜绿假单胞菌添加后PAHs去除效果的影响，探讨表面活性剂对生物添加增效修复PAHs污染土壤的影响。

1 实验

1.1 材料

芘纯度>95%，菲、苊纯度97%，皂角苷纯度BR，均购自上海阿拉丁试剂有限公司；萘纯度99%，购自上海麦克林生化科技有限公司；主要试剂理化性质见表1。

表1主要试剂理化性质

1.2 实验方法

液相降解：向500 mL灭菌三角瓶中加入350 mL灭菌无机盐培养基，含1.0 mg·L-1菲、106CFU·mL-1铜绿假单胞菌和系列浓度皂角苷(0～4 CMC)。在25℃，150 r/min恒温振荡14 d，每2天取样分析菌体生长、菌体表面疏水性、液相及菌体菲的含量。

吸附：称取5 mg失活菌体于22 mL样品瓶内，加入20 mL系列PAHs溶液(含0～4 CMC皂角苷)，25℃ 150 r/min恒温振荡，离心分离后测定上清液中污染物的浓度。

土壤降解：称取1.5 g污染土壤于22 mL样品瓶，加入20 mL系列皂角苷溶液(0～4000 mg·L-1)，25℃ 150 r/min恒温振荡7 d，测定土壤中污染物的浓度。

1.3 分析方法

PAHs采用高效液相色谱仪(Agilent 1260)测定，配PAHs专用色谱柱(4.6×250 mm)，流动相为甲醇/水混合(95∶5,v/v)；荧光检测器检测波长见表1。生物量采用比浊法测定600 nm吸光度OD600[3]。细胞疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)利用吸附法测定[7]，取4 mL清洗复悬菌液(浓度记OD600,i)至8 mL样品瓶，加入1 mL正己烷，涡旋混合20 s后静置30 min，取水相测定OD600,f，按下式计算细胞疏水性。

2 结果与讨论

A: 生长量和菲浓度; B:吸附-降解率和细胞疏水性

图1 铜绿假单胞菌对菲的吸附-降解

图2 假单胞菌对PAHs的等温吸附系数与PAH性质的关系

研究了铜绿假单胞菌对溶液中菲的吸附-降解性能，如图1。假单胞菌可以菲为唯一碳源生长，OD600在第3天达到0.412。随时间增加，碳源逐渐减少，细菌数量开始下降，第15天OD600降到0.214。同时，CSH逐渐减小，由第1天的31.2%降低至第15天的4.7%。铜绿假单胞菌对菲的利用表现为显著的先吸附后降解，这与文献报道一致[3-4]。吸附率在第3天已经达到平衡，维持在12.9%～16.3%；细菌对菲降解率在第15天达到77.9%。

研究了铜绿假单胞菌对PAHs的吸附性能，细菌对4种PAHs的吸附均表现出较好的线性，主要以分配作用为主，其吸附系数(Kd)依次为1564.9、1706.8、10786和12668 L·kg-1，与PAHs的疏水性(logKow)呈显著正相关(logKd=0.66logKow+0.892，如图2)，与文献报道规律一致[8-9]。

A:细菌生物量；B:菲浓度

图3显示了皂角苷对铜绿假单胞菌吸附菲的影响，皂角苷增大了菌体对菲的吸附量。菌体CSH只有4.7%(图1B)，表现为相当强的亲水性，皂角苷分子由亲水端与细菌表面结合，将疏水端暴露在外，从而提供了额外的疏水分配相[4]。

研究了皂角苷对土壤PAHs降解的影响，如图4，低浓度(100 mg·L-1以下)皂角苷促进了菲和芘的去除，而高浓度皂角苷抑制其降解。生物添加铜绿假单胞菌后，并未表现出促进降解或对皂角苷有更好耐受性。进一步研究了皂角苷对铜绿假单胞菌降解菲的影响(图5)，可以看出低浓度皂角苷(4 CMC，即140 mg·L-1以下)基本上降低了细菌的生长量，也降低了细菌对菲的降解，主要是表面活性剂-PAHs复合物、自身或增溶毒性导致[10-12]。结果说明，虽然铜绿假单胞菌具有良好的吸附、降解PAHs性能，但土壤微生物的竞争以及皂角苷的毒性作用，导致其并不能在土壤中发挥作用，因此，在实际土壤修复中添加专性降解菌是需要慎重考虑的。

3 结论

本文发现铜绿假单胞菌可高效降解溶液中菲(可达77.9%)，假单胞菌对PAHs的吸附系数与PAHs的logKow呈线性正相关(logKd=0.66logKow+0.892)。低浓度皂角苷(100 mg·L-1以下)可增加土壤中菲和芘的降解，但会抑制铜绿假单胞菌的生长和降解PAHs能力。铜绿假单胞菌加入土壤中并不会促进土壤PAHs的降解，也没有显示出对高浓度皂角苷的耐受性，生物添加法在实际应用中需慎重考虑。