杨树SHMT基因家族分析及PtrSHMT9突变体创制

李 冰 程玉祥

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase，SHMT）是一种磷酸毗哆醛（PLP）依赖酶，可催化L-丝氨酸和甘氨酸的相互转化，参与转氨基和脱羧反应，在细胞一碳代谢途径中发挥重要作用［1～3］。作为参与基础代谢重要酶类，SHMT在原核生物中常常以二聚体形式存在，而在真核生物中则以四聚体形式存在［4］。拟南芥SHMT 家族有7个成员，AtSHM1和AtSHM2定位在线粒体基质，其他成员存在于细胞质［5～6］。AtSHM1是叶的主要SHMT 酶，缺失导致突变体光呼吸途径被破坏，植株呈现变小、叶片失绿等典型光呼吸突变体缺陷表型［7～9］。光强度、盐、干旱等非生物胁迫加重拟南芥、水稻atshm1和osshm1突变体缺陷表型，深入探究显示SHMT 降低非生物胁迫导致的植物细胞内有毒活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，减轻了细胞内氧化损伤［10～12］。拟南芥异源过表达OsSHMT3 增强其对盐逆境耐受性，体现了植物SHMT 应对非生物胁迫的功效［13］。另外，盐胁迫下AtSHMT1 被泛素化修饰，UBP16 泛素特异蛋白酶对其去泛素化、稳定SHMT 蛋白质总量与酶活性，参与应对盐逆境［14］。

此外，SHMT 是甘氨酸脱羧酶复合物（GDC）亚基，协同调节光呼吸L-丝氨酸和甘氨酸转化，满足多年生木本植物木质化的一碳代谢需求［15］。然而，SHMT家族参与木材形成的功能鲜少报道。本研究识别杨树PtrSHMT 基因家族，分析其表达模式，基于CRISPR/Cas9 技术创制了ptrshmt9 敲除突变体，为进一步鉴定树木SHMT功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

收集温室栽培3个月龄的毛果杨幼树木质部、韧皮部、根、顶芽、叶柄、幼叶和老叶组织，于-80℃超低温冰箱保存，用于SHMT 基因转录表达分析。一个月龄的毛果杨无菌组培幼苗用于遗传转化实验。

1.2 实验方法

1.2.1 毛果杨SHMT家族成员识别

1.2.2 植物总RNA 分离、总cDNA 合成和基因组DNA提取

各组织总RNA 提取参照pBIOZOL（Bioflux 公司）试剂盒说明书，cDNA 合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser（Takara 公司）试剂盒，植物基因组DNA提取采用一步法植物基因组DNA快速提取试剂盒（Bioteke公司），操作参见说明书。

1.2.3 PtrSHMT基因eFP表达热图、在Aspwood转录组数据库检测和定量PCR

从杨树eFP 数据库［18］下载到7 个PtrSHMT 基因表达数据，使用MeV 软件绘制多个组织转录表达水平热图。通过杨树Aspwood 数据库（http：//aspwood.popgenie.org）［19］检测PtrSHMT9 基因在木材形成中的表达水平。

以毛果杨各组织及茎节cDNA 为模板，定量PCR 反应体系20 µL：SYBR Primix Ex TaqTM（2×）10µL，引 物 各0.8 µL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4µL，cDNA 模板1 µL，ddH2O 7 µL。反应程序：95℃30 s，95℃5 s→60℃34 s（40个循环）。每个样品均3次重复，采用2-ΔΔCt方法对基因相对定量分析。

1.2.4 植物基因编辑载体构建

以稀释100 倍的PCBC-DT1T2 质粒为模板，DT1-BsF、DT2-BsR、DT1-F0 和DT2-R0 为引物，用高保真DNA 聚合酶KOD-plus 扩增PtrSHMT9 靶位点序列的gRNA 片段，扩增产物经琼脂糖电泳，胶内的目标DNA 片段被回收，经BsaⅠ酶切和T4 DNA 连接酶连接到pHSE401 植物基因编辑载体［20］。转入DH5α 大肠杆菌，经Kana 抗性筛选阳性pHSE401-gRNA 质粒的菌液，DNA 测序确认重组质粒后转入GV3101农杆菌，用于毛果杨遗传转化实验。实验所用引物及序列参见表1。

1.2.5 毛果杨遗传转化及转基因植株鉴定

由暖暖高级中学图书馆成功举办“我读·故我在—我是元气王”主题巡回书展系列活动的例子可知，倘若学校没有充足的经费购置情绪疗愈素材时，可参考此系列活动内容的筹划与实践过程，由某校发起，借由巡回书展的方式，推广情绪疗愈素材，呼应当代共享经济（sharing economy）的潮流，让邻近学校的学生皆能拥有资源共享的机会，进而接触书展中展示的情绪疗愈绘本、小说及传记等图书信息资源，以让因遭逢挫折而处于情绪低潮的学生，可通过疗愈阅读的方式，舒缓个人的负面情绪，进而找到重新出发的力量。

采用农杆菌介导法对毛果杨遗传转化［21］，选取30 d 左右毛果杨无菌组培幼苗用于转化。取抗性植株的少量叶片，提取基因组DNA，作为模板分别用DT1-F0/DT2-R0 及zCas-U/D 引物（见表1）进行PCR扩增，鉴定其是否转入gRNA和Cas9基因。

1.2.6 转基因植株体内PtrSHMT9 基因靶位点编辑鉴定

取转基因植株基因组DNA 为模板，以PtrSHMT9-U/D 为引物（见表1），进行覆盖靶位点片段的PCR 扩增鉴定。片段胶回收后连接到pMD18-T 载体，转入DH5α 大肠杆菌，Amp 抗性筛选获得阳性菌落，提取质粒进行DNA测序。测序结果与野生型PtrSHMT9进行比对，对位点编辑情况进行统计。

2 结果与分析

2.1 杨树SHMT基因家族识别

从毛果杨基因组上我们识别出9 个PtrSHMT基因（见表2），命名为PtrSHMT1～PtrSHMT9。9 个成员均具有丝氨酸羟甲基转移酶功能结构域，且磷酸吡哆醛结合位点位于该功能结构域内。对毛果杨、拟南芥和水稻SHMT 家族所有成员构建进化树，结果显示21 个SHMT 聚成2 个亚类（见图1A），PtrSHMT1/2/3/5/9、AtSHM4/5/6/7 和OsSHMT2/3/4/5 聚为一类，则PtrSHMT4/6/7/8、AtSHM1/2/3 和OsSHMT1 聚成另一类。基因结构分析显示（图1B），进化树聚类一族的PtrSHMT1/2/3/5/9 具有3个内含子和4 个外显子，另一族PtrSHMT4/6/7/8 分别有12～15个外显子。

表1 所用引物及序列Table1 Primer sequences used in this study

表2 毛果杨SHMT基因家族Table 2 SHMT gene family in Populus trichocarpa

2.2 PtrSHMT基因家族表达分析

杨树eFP 数据显示，7 个PtrSHMT 基因在多个组织内有转录表达，PtrSHMT2/5没有表达数据（见图2A）。PtrSHMT7在幼叶、老叶中表达量很高，而PtrSHMT9 表达量在木质部内呈现高丰度，表明PtrSHMT9 可能参与茎组织生长发育。进一步定量PCR 结果显示，PtrSHMT9 在木质部、韧皮部高丰度表达，在其他组织内几乎检测不到（见图2B）。接着，我们分析了PtrSHMT9 在木材形成中的表达情况，Aspwood检测显示在茎木质组织次生壁加厚和木质部成熟前期阶段PtrSHMT9 呈现高丰度表达水平（见图2C）。

2.3 pHSE401-PtrSHMT9基因编辑载体构建

基于PtrSHMT9 特异性、高丰度地在茎木质组织内表达，我们制备其Cas9/gRNA 编辑突变体。为此，设计PtrSHMT9 基因编辑靶位点（见图3A），构建pHSE401-PtrSHMT9 基因编辑载体（见图3B）。PCR扩增含PtrSHMT9靶位点gRNA片段（见图3C），PCR 产物经琼脂糖电泳后，目标DNA 片段从胶内回收后酶切、连接到pHSE401 植物基因编辑载体上。转化大肠杆菌后PCR 鉴定选出阳性菌落（见图3D），提取其质粒转化GV3101 农杆菌，备用于毛果杨转基因。

2.4 pHSE401-PtrSHMT9 遗传转化毛果杨及其分子鉴定

把约30 d 组培幼苗第2～4 茎节的茎段切成1 cm，农杆菌侵染、暗培养48 h，脱菌后产生抗性愈伤、分化芽，在抗性芽生根后盆栽到温室。累计得到6 棵抗性转化植株，转基因植株分子检测显示：均扩增出Cas9 和gRNA 这2 个目标基因片段，且野生型未扩增出（见图5），表明这两个基因已转入到毛果杨基因组上。

2.5 PtrSHMT9基因位点编辑突变分析

用PtrSHMT9 基因靶位点两侧引物PCR 扩增、片段DNA 测序显示位点编辑如图6A 所示，4 个转基因株系PtrSHMT9 基因靶位点被编辑，L5、L6 株系无编辑。L3株系为纯合编辑，L1/2、L4是两种编辑情况的双等位编辑。PtrSHMT9 基因编辑突变后推测其氨基酸结果如图6B 所示，因编辑产生的移码突变使得PtrSHMT9 基因终止子密码子提前产生，形成了ptrshmt9敲除突变体。

图1 PtrSHMT家族基因结构及其进化树A.PtrSHMT基因家族进化树；B.PtrSHMT基因外显子-内含子结构Fig.1 Gene structure and phylogenetic tree of PtrSHMT gene familyA.Phylogenetic tree of PtrSHMT gene family；B.PtrSHMT gene extron and intron structures

图2 PtrSHMT基因转录表达水平分析A.PtrSHMTs电子表达数据；B. 定量PCR分析PtrSHMT9在不同组织内的相对表达水平；C.Aspwood转录组检测PtrSHMT9表达水平Fig.2 Analysis of transcript expression level of PtrSHMT geneA.Electronic expression data of PtrSHMTs；B.Quantitative PCR analysis of relative expression level of PtrSHMT9 in different tissues；C.Aspwood detected the expression level of PtrSHMT9

图3 pHSE401-PtrSHMT9基因编辑载体构建A.PtrSHMT9 基因编辑靶位点；B.pHSE401 基因编辑载体图；C.PCR 扩增含PtrSHMT9靶位点gRNA；D.pHSE401-PtrSHMT9转化农杆菌菌液PCR鉴定Fig.3 Construction of pHSE401-PtrSHMT9 editing vectorA. The target site of PtrSHMT9；B. Gene editing of pHSE401；C. PCR amplification of gRNA containing PtrSHMT9 target site；D. PCR identification of pHSE401-PtrSHMT9

图4 pHSE401-PtrSHMT9转化毛果杨A. 待转化幼苗；B. 侵染；C. 暗培养；D. 抗性筛选；E. 诱导抗性芽；F. 生根和盆栽Fig.4 Transformation of P.trichocarpa with pHSE401-PtrSHMT9A.Seedlings to be transformed；B.Infestation；C.Dark culture；D.Resistance selection；E.Resistant shoots；F.rooting and potting

图5 PpHSE401-PtrSHMT9转基因杨树分子鉴定L1～6.6个独立的转基因株系；WT. 野生型Fig.5 Molecular identification of transgenic P.trichocarpa with pHSE401-PtrSHMT9L1-6.Six independent transgenic lines；WT.Wild type

图6 PtrSHMT9基因编辑及突变分析A. 转基因株系PtrSHMT9基因编辑情况；B.PtrSHMT9编辑突变后推测氨基酸Fig.6 PtrSHMT9 gene editing and mutation analysisA.PtrSHMT9 gene editing in transgenic plants；B.Amino acids are deduced from the edited PtrSHMT9

3 讨论

植物的SHMT 是一个小基因家族，拟南芥、水稻SHMT 分别有7 个和5 个成员［5，13］。我们从毛果杨中识别出9 个SHMT 基因，与单子叶水稻相比其成员数量明显增多。拟南芥、水稻和毛果杨SHMT所有成员进化树聚成2 个簇，PtrSHMT1/2/3/5/9 聚成一簇，PtrSHMT4/6/7/8聚成另一簇。从基因结构数据看，PtrSHMT1/2/3/5/9 这5 个基因外显子-内含子结构相同，PtrSHMT4/6/7/8 这4 个基因结构也类似。PtrSHMT 基因家族的进化分析结果和基因结构数据表现一致。

基因表达的模式常暗示其功能。基于杨树eFP转录表达电子数据库［18］和定量PCR检测，鉴定出PtrSHMT9在木质部组织高丰度表达，PtrSHMT9可能作用于茎的生长发育。Aspwood 是一个木材形成的全基因组转录表达数据库［19］，检索结果显示PtrSHMT9 表达在茎木质组织次生壁加厚阶段呈现高丰度水平。树木有着巨大的、累积的次生木质化组织，木质素、细胞壁多糖是其主要次生代谢物。一碳代谢物除了参与初级代谢，还供给次级代谢途径，植物木质化是一碳密集的代谢途径之一［22～23］。树木SHMTs 与甘氨酸脱羧酶形成复合体进行甘氨酸—丝氨酸转换，形成的一碳供给非光合组织合成多种次级代谢物［15］。木质部高丰度、特异表达的PtrSHMT9 很可能作用杨树次生壁合成，参与木材的形成。

然而，遗传证据能准确地显示PtrSHMT9 基因功能。Cas9/gRNA 基因编辑技术在拟南芥、玉米、水稻等物种上广泛应用，获得遗传突变体用于功能鉴定［24～25］。在这次研究中我们构建了PtrSHMT9基因Cas9/gRNA 编辑载体，结合毛果杨转基因技术实现了PtrSHMT9 基因编辑突变，获得4 个不同株系的毛果杨ptrshmt9敲除突变体。接下来，我们将分析ptrshmt9 突变体表型，聚焦PtrSHMT9 敲除对次生壁结构和木材组分的影响，鉴定PtrSHMT9基因在木材形成上的功能，理解树木SHMTs 参与的次级代谢途径及作用方式。