心脏移植物血管病中NF-κB通路对血管平滑肌细胞的影响

张鹏， 张松林

三峡大学第一临床医学院、宜昌市中心人民医院心血管外科(湖北宜昌 443002)

心脏移植已经成为选择性治疗终末期心力衰竭患者的标准[1]，而心脏移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy,CAV)仍然是制约心脏移植后长期存活的致命弱点。几乎1/3的患者在移植后的5年发展成CAV，1/8患者在1年内的死因是由于CAV[2]。CAV的发病机制尚不明确，主要是固有免疫和适应性免疫反应介导的慢性排斥反应，其他因素主要包括：急性排斥反应，缺血-再灌注损伤，巨细胞病毒感染等[3-4]。综合因素的作用最终导致冠状动脉闭塞性狭窄，心脏微脉管系统弥漫性同心圆样内膜增厚[5]，其进展主要表现为:(1)单核炎症细胞在内膜的浸润；(2)单核细胞的浸润联合血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)以及疏松的结缔组织;(3)形成不伴有明显炎症细胞浸润的致密结缔组织[6]。其中新生内膜平滑肌细胞的增殖和迁移起重要的作用[7]。目前CAV并没有特效的药物治疗，而且免疫抑制剂的长期使用不良反应显著，所以在免疫抑制剂的基础上，更多研究转向了免疫调节对CAV的影响中[1，7]。核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途径是经典的促炎信号途径，其调控着促炎细胞因子的产生、白细胞的招募和细胞生存，对促进炎症反应具有重要作用[8]。NF-κB二聚体结合于IκB位点通过招募共激活和共抑制因子在靶基因的启动子/增强子内调控转录[9]。静息状态下，NF-κB的P65亚基与其抑制因子IκB结合成复合物存在于胞质中，在缺血缺氧，机械损伤和氧化应激等条件下,NF-κB转移到胞核中与相应的转录基因结合，参与炎症反应、免疫应答，自由基损伤等病理过程。NF-κB同样参与了移植物血管病的病情发展[10]，而平滑肌细胞是血管新生内膜的主要组成部分，对移植物血管的腔内闭塞至关重要[11]。本文将总结NF-κB信号途径下血管平滑肌细胞在CAV进展中的作用，为进一步理解CAV的发病机制和治疗靶点提供实验理论依据。

1 平滑肌细胞(SMCs)的来源

CAV内膜细胞中以SMCs为主，据研究其有不同来源：(1)内膜，SMCs的单纯增殖；(2)中膜，SMCs的迁移；(3)祖细胞存在于中膜/外膜的边界；(4)循环宿主细胞，被招募到血管损伤部位，而且新生的内膜SMCs与中膜SMCs相比有不同的表型[12]。在啮齿类动物模型中，移植物血管损伤的病变结果常常是由宿主来源的SMCs增殖所组成，而人的CAV病变中SMCs主要为供体来源[3]。Amano等[13]通过微型猪建立的CAV模型中，以雌性为供体雄性为受体，利用荧光原位杂交分析发现，增殖的细胞主要为1号染色体DNA探针，很少有Y染色体探针，进而得出增殖的SMCs主要来源于供体，并且通过鉴别增厚内膜的标记物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和平滑肌肌球蛋白重链胚胎型(SMemb)发现，内膜SMCs增殖类型主要为胚系/分泌性类型。Atkinson等[14]的研究同样发现，在性别错配组中(男性为受体，女性为供体)，平滑肌肌动蛋白染色及Y探针染色在中膜或外膜SMCs中未见双重染色，而新生内膜中的SMCs也呈Y-探针染色阴性，这些表明SMCs是来源于供体自身的，而循环祖细胞在人类移植CAV的新内膜中似乎没有发挥作用。

2 NF-κB信号的激活因素

2.1 高血压 在自发性高血压大鼠模型中，Sun等[15]发现，VSMC胞核中的p65-NF-κB水平和NF-κB荧光素酶报告基因有所增加，而p65-NF-κB结合到NLRP3(核苷酸结合的寡聚域样受体蛋白3)启动子同样增高，NLRP3激活下，VSMC的合成蛋白骨桥蛋白(osteopontin,OPN)有所增高，而收缩蛋白如α-SMA和SM22α有所降低，而在NF-κB抑制剂BAY11-7082 下可明显缓解以上VSMC类型的转变，并可降低增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达，抑制VSMC的增殖。这说明在自发性高血压因素影响下，通过激活NF-κB途径可增加VSMC表型的转变和细胞的增殖。

2.2 糖尿病 Di等[16]在研究2型糖尿病中，发现在晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)作用下，p65-NF-κB从胞质转移到胞核，IκBα也同时减少，SMC收缩标记α-actin和MYH11明显降低，而用PDTC阻断NF-κB途径可抑制SMC收缩标记和心肌素的减少，这说明在AGE的影响下，通过NF-κB途径可影响SMC表型的转变。

2.3 吸烟 Wang等[17]的研究发现，香烟中的主要成分尼古丁可诱导VSMC高表达活性氧(reactive oxygen species,ROS)并且增加p65和IκBα的磷酸化水平进而激活NF-κB途径，而利用ROS清除剂可稳定氧化应激下的α-SMA和SM22α的表达水平，降低VSMC迁移能力；同样用选择性IκBα磷酸化-NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082可提高α-SMA和SM22Α的表达，降低OPN水平，从而逆转了VSMC的类型转变。可见ROS/NF-κB信号途径在尼古丁诱导的VSMC表型转变和迁移中有重要作用。

同样,Lu等[18]试验中，发现血小板源性生长因子-BB(platelet derived growth factor,PDGF-BB)培养下的VSMC可增加超氧阴离子的表达，促进p65-NF-κB从胞质到胞核的转移和IκBα的磷酸化，而利用ROS清除剂后可明显缓解VSMC收缩基因α-SMA的减少和合成性基因OPN的增加，而这与NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082的作用相同，并且增殖标记如PCNA, 细胞周期蛋白D1和P27有所恢复。其阐明了PDGF-BB诱导下ROS/NF-κB通路在VSMC的类型转变、增殖和迁移中的作用。

2.4 血脂异常 Kang等[19]通过球囊损伤后血管蛋白组学分析发现，氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidized LDL receptor-1,OLR1)在VSMC增殖和迁移中的双重作用。利用最低限度氧化低密度脂蛋白可诱导磷酸化依赖性IκBα的减退，增加了NF-κB与DNA的结合活性，而阻断OLR1可抑制NF-κB的活化和ICAM依赖性单核细胞对VSMC的黏附作用；损耗或消除OLR1也可使PDGFRβ的激活受损，从而影响PDGF对VSMC的增殖作用，揭示出OLR1为PDGFRβ的潜在共受体并在VSMC中协调生长信号和炎症反应。这进一步显示出NF-κB信号通路在VSCMs增生中的重要作用。

2.5 其他因素 如高磷酸盐可通过toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)激活NF-κB途径，释放炎症因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，参与了VSMCs的炎症反应和合成/分泌型细胞的转变[20]；同样在慢性阻塞性肺疾病鼠模型中，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可诱导肺动脉平滑肌细胞高表达TLR4，通过NF-κB途径的活化，表达炎症因子γ干扰素(IFN-γ)参与了炎症反应和血管平滑肌的重塑[21]；而在球囊损伤试验中，动脉新生内膜的增厚与高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB-1)和NF-κB的表达量具有时间依从性，HMGB-1可由坏死细胞、内毒素(LPS)、IL-1和TNF-α激活的单核巨噬细胞和树突状细胞分泌，结合于toll样受体同样参与了NF-κB途径的激活，在内膜增生中调节着炎症和免疫反应[22]；生存素可能作为NF-κB的下游基因，在球囊损伤试验中对VSMC的增殖和类型转变有明显的促进作用，而NF-κB的激活在其中扮演着重要角色[23]。

3 NF-κB信号抑制

3.1 转录因子诱惑物 将转录因子诱惑物(transcription factor decoy,TFD)转染细胞可竞争性抑制NF-κB与启动子的结合，受抑制的NF-κB可减少细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和内皮细胞-白细胞黏附分子-1(ELAM-1)的mRNA的表达水平，减少再灌注损伤、急性和慢性排斥反应，适度延长移植物存活时间并可显著减少冠状动脉疾病，可见心脏移植后，及时阻断NF-κB可改善心脏移植后的预后[24]。

3.2 基因转染 用转基因鼠使内皮细胞表达显性抑制IκBα(E-DNIκB mice)，在袖套股动脉损伤中，可显著降低炎症因子如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、TNF-α、IL-1β和IL-6，以及SMC增殖相关因子如血小板源性生长因子-B(platelet-derived growth factor-B, PDGFB)的表达，抑制了动脉损伤的炎症反应和SMC的增殖效应[25]。

3.3 二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC) 在异位心脏移植鼠模型中，与环孢霉素A组相比，NF-κB抑制剂PDTC组的移植物存活时间更长，炎症细胞的浸润和心肌纤维化水平也较轻，MCP-1表达水平也显著降低，而且MCP-1可作为反映心脏移植物排斥严重程度的指标，在NF-κB阻断的心脏排斥反应中具有重要作用[26]。

4 MicroRNA与NF-κB

微小RNAs(micro RNAs, miRNAs)是内源性18～24个核苷酸长的非编码RNAs,它们结合与靶向mRNA的3’非转录区(3’UTR)诱导其降解或抑制转录，在细胞的增殖、迁移和凋亡中具有重要的调节作用。

4.1 miR-155 Park等[27]给予人动脉平滑肌细胞TNF-α后，发现其中miR-155的生物合成以时间依赖的方式显著增加，而NF-κB抑制剂Bay11-7082可阻断其增加效应。NF-κB依赖的miR-155对诱导性NO合酶(iNOS)具有负调节作用，而NO 可激活可溶性鸟苷酸环化酶/环磷酸鸟苷(sGC/cGMP)信号通路，其在维持VSMC的舒张、增殖和类型转变中具有重要作用，其结果表明NF-κB依赖的miR-155的增加可使sGC/cGMP通路受损，促进VSMC的类型转变和增殖。

另一项研究同样发现TNF-α下的人和鼠动脉平滑肌的表型从收缩型向合成分泌型的转变，而miR-155-5p抑制剂下，可明显抑制VSMC的增殖、迁移和类型的转变，NF-κB抑制剂Bay11-7082也可阻止收缩型标记基因α-SMA、SM22a、MHC11的下降。其作用机制可能为TNF-α下NF-κB反应性miR-155-5p水平增高，可负性调节环磷酸鸟苷依赖的蛋白激酶1(cGMP-dependent protein kinase1,PKG1)，从而损伤NO/cGMP通路介导的VSMC收缩表型和血管松弛的维持，并促进VSMC的增殖和迁移[28]。

4.2 miR-17 Yang等[29]研究表明miR-17的表达可增加VSMC中PCNA和E2F1水平，通过加强G1/S期的过渡，促进细胞周期的进展，刺激了VSMC增殖。而NF-κB p65信号的活化可显著增加miR-17在VSMC中的水平，并降低了视网膜母细胞瘤RB基因的表达(retinoblastoma,RB)，miR-17抑制剂则可消除对RB的抑制。NF-κB p65亚基可结合于miR-17的启动子，诱导其转录；而miR-17可靶向结合于RB蛋白mRNA-3′非翻译区，抑制其基因的表达，促进细胞的增殖，从而表明了NF-κB p65/miR-17/RB通路在VSMC增殖中的重要作用。

4.3 miR-27a/b 剂量和时间依赖下的内皮素1(endothelin-1，ET-1)可导致鼠肺动脉平滑肌细胞的过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)表达下降和细胞的增殖，而增高的miR-27a/b可直接结合于PPARγ mRNA的3′非转录区，控制SMC的增殖。增高的miR-27a/b受NF-κB调控(结合于miR-27a/b启动子区域)，在内皮素-1的影响下，下调PPARγ表达水平，促进SMC的增殖。这表明NF-κB信号的活化可增强miR-27a/b的表达，从而下调PPARγ并促进SMC的增殖[30]。

5 NF-κB通路的调节

5.1 miR-132/212 Kong等[31]研究发现，独立于IκBα的磷酸化和降解，胞质中的环形RNA-沉默调节蛋白1(circular RNA-sirtuins-1,circ-Sirt1)可形成circ-Sirt1-NF-κB p65失活复合物，从而阻止NF-κB p65向胞核的转移，或通过竞争性结合miR-132/212促进了SIRT1基因(silent information regulator transcript-1)的表达，使NF-κB p65去乙酰化而失活。circ-Sirt1在人和大鼠新内膜增生及VSMC病理刺激下表达水平降低。通过病毒载体转染，TNF-α可诱导人肾动脉平滑肌细胞表达外生性circ-Sirt1， 降低了VCAM-1、ICAM-1和MCP-1 mRNA表达水平，而circ-Sirt1过表达可抑制VSMC的炎症表型转换(人和鼠体内外)，改善损伤性血管炎症和新生内膜的形成。可见circ-Sirt1可调节NF-κB在胞质和胞核中的活化，具有协同抗炎和抑制VSMC表型转变的作用。

在PDGF-BB作用下，VSMCs中的miR-29b表达量增加并伴随其分化相关基因的表达降低如α-SMA、SM-MHC和Sirt1，促进了VSMC的表型转变。而miR-29b抑制剂增加了VSMC分化标志物基因的表达，并且加强了NF-κB的活化。Sirt1敲低部分逆转了这些基因的表达，并且miR-29b能可逆地调节Sirt1蛋白水平，这表明miR-29b可通过抑制Sirt1/NF-κB途径调控VSMC的表型转变[32]。

5.2 miR-30e 泛素结合酶E2I (ubiquitin-conjugating enzyme E2I,Ube2i) 可通过修饰关键酶从而抑制靶蛋白的降解，在很多过程中对维持和调节靶蛋白水平具有重要作用。Zong等[33]的研究中发现miR-30e在调控VSMC的增殖、迁移、分化和凋亡中扮演着重要角色。增殖和迁移的VSMCs中miR-30e表达水平降低，而Ube2i蛋白和NF-κB水平增高；通过荧光素酶报告实验发现Ube2i为内源性miR-30e的靶基因，而Ube2i可促进IκBα的降解，激活NF-κB信号通路。miR-30e通过与Ube2i的靶向结合，并下调IκBα/NF-κB信号通路，在抑制VSMC的增殖、迁移和促进凋亡中具有重要作用。

6 总结与展望

尽管过去30年中免疫抑制有所改善，但CAV发生率并没有显著下降，并且它的进展仍然限制着心脏移植患者的长期存活。

综上所述，NF-κB作为促炎信号分子在血管平滑肌细胞的增殖和迁移中具有重要作用，CAV中的多种危险因素如高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、氧化应激等都可激活NF-κB信号通路。激活的NF-κB转移到胞核，通过诱导黏附分子和炎症因子的表达，促进VSMC的增殖、迁移和表型的转变。各种抑制NF-κB通路的方法都可降低ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表达，阻止VSMCs收缩性标记α-SMA、SM22a的下降，从而逆转了NF-κB激活引起的血管平滑肌细胞的增殖，迁移和表型转变。MiRNA在细胞的增殖、迁移和凋亡中具有重要的调节作用，如与NF-κB信号相关的miR-155、miR-155-5p、miR-17、miR-27a/b可通过不同机制参与VSMC的增殖、迁移和表型转换；而miR-132/212、miR-29b和miR-30e可分别通过Sirt1/NF-κB、Ube2i/IκBα/NF-κB通路机制调控NF-κB的活性，参与了VSMC的增殖、迁移和表型转换。可见NF-κB信号途径对VSMC的病理变化具有重要促进作用，在CAV的早期和慢性炎症反应中促进CAV的发展，其可作为免疫抑制剂的辅助作用靶点，从而改善CAV进展，延长移植物存活时间。