靶向冠状病毒酶的治疗药物研究进展*

孙康悦，蓝智贤，李跃，刘思德

南方医科大学南方医院消化科(广东省胃肠疾病重点实验室)(广东广州 510515)

冠状病毒(coronaviruses, CoV)是一种有包膜的单正链RNA病毒，可感染大部分哺乳动物，引起呼吸道、胃肠道等症状。CoV被分为4个属，分别是α、β、γ和δ，β-CoV中的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome CoV, SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome CoV, MERS-CoV)，和近期的新型冠状病毒导致了全球范围内的暴发流行，可引起人类呼吸功能衰竭以至死亡。近十几年来，人们对于CoV的生物学性状、致病性进行了大量研究，其中参与病毒复制、转录的蛋白酶类受到了关注，被认为是可以用于治疗包括此次新型冠状病毒在内的CoV感染的潜在靶点。现就靶向CoV酶的药物作一综述。

1 CoV的基因组结构及其增殖过程

CoV呈球形，直径为120～160 nm，其基因组为非分节段的单正链RNA，大小约为26～32 kb，是已知的基因组最大的RNA病毒。靠近基因组5′端2/3位置的基因组包含2个大的重叠的开放读码框(open reading frame, ORF)，ORF1a和ORF1b主要负责编码与病毒复制转录有关的酶类等非结构蛋白，包括复制酶聚蛋白1a(replicase polyprotein 1a,pp1a)和pp1ab，它们被木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain like cysteine protease, PLpro)和3C样丝氨酸蛋白酶(3C like serine protease, 3CLpro)裂解，产生具有复制和转录功能的非结构蛋白(non structural proteins, NSPs)。靠近3′端1/3位置的基因负责编码病毒的结构蛋白，包括核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N)、包膜蛋白(membrane protein, M)、膜蛋白(envelope protein, E)和刺突糖蛋白(spik glycoprotein, S)，这些蛋白的功能包括介导病毒与细胞融合，病毒装配等[1]。

病毒表面S蛋白的S1亚基与宿主细胞表面的受体结合后导致S2亚基构象变化，使病毒膜和宿主细胞膜融合，病毒得以进入细胞[1]。CoV在细胞内分解，RNA被释放到胞质中，利用宿主的核糖体将自身的ORF1a和ORF1b翻译为pp1a和pp1ab，同时复制其RNA[2]。pp1a和pp1ab被PLpro和3CLpro裂解，产生NSPs，包括RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和解旋酶(helicase, Hel)。NSPs形成CoV复制-转录复合体，该复合体的疏水域和源自内质网的限制性膜附着，形成典型的CoV复制结构，包括双膜囊泡和回旋膜[3]。基于以上结构，CoV扩增其RNA，翻译结构蛋白和辅助蛋白，形成装配好的病毒并通过胞吐释放至细胞外，完成其增殖过程并接着感染其他细胞。

2 基于CoV蛋白酶的治疗药物

CoV复制中涉及的所有主要酶和蛋白质都是潜在的治疗靶标。SARS-CoV和MERS-CoV的PLpro具有蛋白水解、去泛素化(deubiquitylating)和去ISG化(deISGylating)的作用[4]。晶体学促进了这些PLpro的表征和PLpro抑制剂的鉴定[5]。人们已发现许多不同类别的SARS-CoV PLpro抑制剂，包括小分子抑制剂、硫嘌呤化合物、天然物质、锌离子和锌结合物抑制剂以及萘抑制剂[6]。但是，其中一些药物仅抑制PLpro的酶活性而不抑制病毒复制；且没有一项抑制剂在动物或人体研究中得到验证[6-7]。此外，由于不同CoV的PLpro之间有结构差异，大多数PLpro抑制剂都是窄谱活性的。例如，大多数SARS-CoV的PLpro抑制剂对MERS-CoV无作用[8]。

3CLpro是另一种主要的CoV蛋白酶，可在病毒复制过程中裂解较大的复制酶聚蛋白。饶子和院士团队已经解析了新型冠状病毒3CLpro的晶体结构(PDB ID: 6LU7)，这为筛选相关抑制剂提供了重要帮助。SARS-CoV 3CLpro可以被多种蛋白酶抑制剂靶向，包括锌或汞结合物、酸酐、苯并三唑、N-苯基-2-乙酰胺、联苯砜、嘧啶酮和吡唑类似物等[9]。因为CoV的3CLpro在这些抑制剂所识别的区域为进化保守的，一些3CLpro抑制剂在体外实验中呈广谱活性[10]。在这些抑制剂中，已上市的有洛匹那韦(lopinavir)，这是一种用于治疗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染的蛋白酶抑制剂，通常以利托那韦(ritonavir)增强形式销售。洛匹那韦和(或)洛匹那韦-利托那韦在体外以及在MERS-CoV感染的非人类灵长类动物的试验中均具有抗CoV活性[11-12]。近期，有一项关于洛匹那韦-利托那韦联合β1b干扰素治疗MERS的两阶段随机对照实验正在展开，其疗效和是否会产生耐药性有待进一步观察[13]。

RdRp是CoV复制-转录复合体的重要组成部分，参与基因组和亚基因组RNA的合成。利巴韦林(ribavirin)是一种具有广谱抗病毒活性的鸟嘌呤类似物，已被用于治疗严重的呼吸道合胞病毒感染，丙肝病毒感染和病毒性出血热。高剂量的利巴韦林在体外实验，以及感染了MERS-CoV的猕猴中均表现出一定的抗病毒活性，但在数量有限的MERS患者中没有明显的生存获益[14-15]。此外，与大剂量利巴韦林相关的严重不良反应限制了其在严重CoV感染患者中的临床应用[16]。一种新型的腺苷类似物BCX4430(Immucillin-A)是非专性RNA链终止剂，可抑制多种RNA病毒的RNA聚合酶，包括诸如SARS-CoV和MERS-CoV在内的CoV以及诸如埃博拉病毒和马尔堡病毒等丝状病毒[17]。现有的核苷类似物，例如阿昔洛韦(acyclovir)，可以通过加入柔韧性修饰剂进行修饰，柔韧性修饰剂可增强核苷类似物的亲和力，并可克服由结合位点突变引起的抗药性[18]。近期《新英格兰医学杂志》在线发表了美国首例确诊新型冠状病毒肺炎患者的诊疗过程，其中还未上市的核苷类似物前药remdesivir显示了一定的疗效，它原计划用于治疗埃博拉病毒感染[19]；随后，中国学者进行的体外实验验证了其在体外有抗病毒作用[20]。除核苷类似物外，针对SARS-CoV RdRp的siRNA分子已在体外实验显示出对于病毒的抑制作用[21]。但其距在人类中应用还有很长距离。

在CoV的复制周期中，Hel在三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)依赖性反应中催化双链寡核苷酸解链成单链。因不同CoV的Hel高度同源，Hel抑制剂是十分具有吸引力的药物。基于其作用机制，Hel抑制剂可大致分为两类。一类包括果胶苷和5-羟色酮衍生物，它们抑制SARS-CoV Hel的解旋和ATP酶活性，从而抑制病毒的体外复制[22]。但是，这些化合物对细胞ATP酶或激酶的抑制作用所产生的毒性限制了其在人类中的应用。另一类是选择性抑制CoV Hel的解旋活性但不抑制其ATP酶活性的化合物。比如SSYA10-001，它是一种三唑类药物，可抑制多种CoV，包括SARS-CoV、MERS-CoV和小鼠肝炎病毒[23]。

3 其他

除靶向病毒复制、转录相关酶外，针对病毒与宿主细胞结合过程的人源或人源化单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb)、抑制剂等也是有潜力的抗病毒药物。这些mAb可结合S蛋白S1亚基的受体结合域(receptor-binding domain, RBD)，或作用于S2亚基，分别阻止病毒与宿主细胞的结合和中断病毒膜与细胞膜融合[24]。研究显示新型冠状病毒与SARS-CoV一样，与细胞融合需借助细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)，并需要跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2辅助[25]；因此ACE2和TMPRSS2的抑制剂可发挥抗病毒作用[26]。病毒的其他结构蛋白E、N、M和辅助蛋白在病毒装配及抑制宿主免疫反应中也发挥了作用，针对这些蛋白研究人员也研发了一些有抑制病毒作用的干扰RNA和siRNA[27-28]。另外，体外实验证明抗疟疾老药氯喹也有抗新型冠状病毒的作用[20]。

CoV作为单链RNA病毒比双链病毒具有更丰富的生物多样性，从2002年的SARS，2012年的MERS到近期出现的新型冠状病毒，提示研究人员在CoV的药物研发中，应格外着重于抗β-CoV或抗RNA病毒的广谱药物，并抵御病毒的耐药性。其实现方式可能是：(1)单一的药物，如非专性核苷类似物，或针对进化保守的蛋白酶的抑制剂等；(2)两种及以上靶向病毒结构蛋白不同表位的mAb或靶向病毒蛋白酶的核甘类似物(及其前药)与mAb联合使用。以上药物在体外和(或)体内实验中显示出一定的抗病毒作用后，其应用于人类的疗效和安全性还需进一步研究。