AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态性的表达与AECOPD 并发肺心病的相关性研究

李 红，朱丽娟，马 宣

由于慢性阻塞性疾病患者长时间处于慢性缺氧状态，极易产生血黏度增加、红细胞继发性增多、血小板活化等，造成血小板聚集、黏附，明显增加血液黏度，引起肺动脉高压，最终诱发肺心病，加重患者病情发展，甚至危及患者生命安全［1-2］。因此，详细了解慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）合并肺心病的发病机制并采取有效的预防措施，已成为目前研究的重点内容。血管紧张素转化酶（ACE）是肾素-血管紧张素系统中的关键酶，可催化血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ，并经ATⅡ1 型受体（AT1R）发挥收缩血管的作用［3］。而由于肺组织具有丰富的血管床，且细胞外是ACE 所处位置，可增强转化效果。纤溶酶原活化剂抑制物-1（PAI-1）在纤溶系统中有着重要作用，可通过对纤溶酶的抑制作用实现降解细胞外基质的效果［4-5］。基于此，本研究对AECOPD合并肺心病及未合并肺心病患者进行对照研究，进一步探讨AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态表达与AECOPD 并发肺心病的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2016 年7 月-2018 年9 月就诊的AECOPD 并肺心病患者38 例为观察组，并选取同期AECOPD 患者38 例为对照组。观察组中男25 例，女13 例，年龄42～81 岁，平均年龄（67.92±9.81）岁。对照组中男23 例，女15 例，年龄42～80 岁，平均年龄（67.89±9.87）岁。2 组患者性别及年龄对比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。入选者均自愿参与本研究，并签署知情同意书，医学伦理委员会审核本研究方案。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合《慢性阻塞性肺疾病诊断指南（2013 年修订版）》［6］中AECOPD 诊断标准；②无其他严重并发症；③处于肺心病肺心功能失代偿期；④经肺功能、胸部X、血气等检查确诊AECOPD 并发呼吸衰竭。

1.2.2 排除标准：①精神病；②合并恶性肿瘤、免疫系统疾病、组织创伤及非肺部感染。

1.3 方法：采集所有受试者空腹静脉血5 mL，放于EDTA 抗凝管中，离心处理（1 200 r/min）10 min 后，取血浆保存在另一离心管中。使用吸管将下层血浆和白细胞层约1 mL 吸取至高压灭菌的离心管中，通过氯仿、酚、异戊醇法抽取体细胞DNA。①ACE 基因多态性检测：由上海生工生物工程公司合成的PCR引物，序列为antisense primer 5’-GATGTGGCCATCATTCGTCAGAT-3’，Sense primer 5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’。PCR 扩增参数：94 ℃预变性5 min，之后94 ℃1 min，55 ℃60 s，72 ℃60 s，共35个循环，之后72 ℃延伸10 min。②AT1R 基因多态性检测：TA1R 基因多态性采用PCR 结合限制性酶切技术进行检测，经限制性核酸内切酶酶切法分析扩增产区，由无酶切位点判断A1166C 位。PCR 反应引物序列：下游引物5’-TTGCATTGAGATCTGTCAGT-3’，上游引物5’-ATAATGTAAGCTCATCCACC-3’。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min、94 ℃50 s、57 ℃40 s、72 ℃60 s，共33 个循环，最后72 ℃延伸10 min。③PAI-1 基因多态性检测：采用酶联免疫吸附法测定血浆PAI-1 抗原水平。4G/5G 基因型分析：采用等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交技术对基因型进行分析。PCR 反应引物为5’-GGA GCTGCAGGAATTCAGCTGCTGGA-3’和5’-AAGCTTTTACCATGGTAA-CCCCTGGT-3’。PCR 反 应 体 系100 μL，含MgCl21.5 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、两种引物各0.25 μmol/L、10×PCR 缓冲液10 μL 及上述DNA 提取液5 μL，并用双蒸水补足。95 ℃预变性10 min后，将50 μL 液体石蜡和2U Taq 酶加入。循环参数：95 ℃60 s、55 ℃60 s、72 ℃60 s，共循环35 个，最后72 ℃延伸5 min。采用5’-ACGTGGGGGAGTCA-3’和5’-CACGTGGGGAGTCA-3’。取PCR 产物液常规点膜、变性，分别与γ32P-ATP 标记的4G、5G 探针杂交和放射自显影。

1.4 评价指标：①ACE 基因型和等位基因分布：统计两组ACE 基因型频率（DD、ID、Ⅱ）和等位基因频率（D、Ⅰ）情况。②AT1R 基因型和等位基因分布：统计两组基因型频率（AA、AC）及等位基因频率（A、C）情况。③PAI-1 基因多态性表达：统计两组PAI-1 基因多态性4G/4G、4G/5G、5G/5G 表达情况。④相关性：采用Pearson 分析AECOPD 合并肺心病发生与ACE、AT1R 及PAI-1 基因多态性表达的相关性［7-8］。

1.5 统计学方法：采用SPSS 25.0 统计学软件，计量资料采用±s 表示，组间比较采用t 检验；采用Pearson相关分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACE 基因型和等位基因分布：观察组患者ACE基因型频率（DD、ID）和等位基因频率（D）高于对照组，基因型频率Ⅱ和等位基因频率Ⅰ低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 2 组患者ACE 基因型频率和等位基因频率分布比较［n（%）］

2.2 AT1R 基因型和等位基因分布：观察组患者AT1R基因型频率（AA、AC）及等位基因频率A 高于对照组，AT1R 基因型频率CC 和等位基因频率C 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 2 组患者AT1R 基因型和等位基因分布对比［n（%）］

2.3 PAI-1 基因多态性表达：观察组PAI-1 基因多态性表达（4G/4G、4G/5G、5G/5G）高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 2 组患者PAI-1 基因多态性表达对比

2.4 相关性分析：AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态性表达与AECOPD 并发肺心病呈正相关性（P＜0.05）。

3 讨论

由于AECOPD 合并肺心病患者常有不同程度的低氧血症、二氧化碳潴留等症状存在，加重通气换气功能障碍，造成血液黏度及红细胞比容增加，引起肺动脉高压、肺组织血流速缓慢及血管内皮损伤等病理改变，加重心脏负荷量，导致肺功能呈进行性减退，最终引起呼吸衰竭和心力衰竭，危及患者生命健康［9-10］。因此，早期明确疾病发生机制并采取干预措施尤为重要。

人类第17 号染色体长臂2 区3 带（17q23）是ACE 基因所处位置，是全程21 kb 的单拷贝基因，包含25 个内含子和26 个外显子，其中第16 内含子内有287 bp 的Alu 序列的插入/缺失（I/D）多态性存在，进而形成两种等位基因和DD、ID、Ⅱ3 种基因型［11-12］。ACE 基因编码产物可在体内各种组织中广泛存在，属于血管紧张素转换酶，可使血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，使缩血管作用得到发挥［13］。AT1R 基因长度约5 kb，固定在染色体3q21～3q25 上，且外显子个数超过5 个，其表达物为血管紧张素Ⅱ，可通过将特异性受体激活发挥生物学效应［14］。AT1R 基因3’非翻译区第1166 位点腺嘌呤突变为胞嘧啶，产生AT1R A1166C 基因多肽，产生CC、AC、AA 3 种基因型［15］。本研究结果显示，观察组ACE 基因型频率（DD、ID）和等位基因频率（D）高于对照组，基因型频率Ⅱ和等位基因频率Ⅰ低于对照组；观察组AT1R 基因型频率（AA、AC）及等位基因频率A 高于对照组，AT1R 基因型频率CC 和等位基因频率C 低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。分析其原因，除了肺部本身具体结构及功能的特殊性，代谢、遗传及种族差异等因素也将对ACE、AT1R 基因的多态性造成阴性；同时实验设计及检验方法的误差、人群和样本的差异等也将对检验的结果造成影响，例如AECOPD合并高血压、冠心病等［16］。此外，ACE、AT1R 基因多态性采用PCR 测定时，易造成ID 型被误认为DD 型等，对研究结果造成影响。

循环血浆PAI-1 水平受高血压、肥胖、血甘油三酯、血糖等多种代谢因素的影响，而试验过程中很难排除上述因素的影响，而基因则不受外界环境因素的影响，故对PAI-14G/5G 多态性和AECOPD 合并肺心病的关系［17］。但本研究中，观察组PAI-1 基因多态性表达（4G/4G、4G/5G、5G/5G）高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。激活肾素-血管紧张素系统，将增加血管紧张素Ⅱ水平，转化为生长因子-β1 分泌，进而对内皮细胞合成分泌PAI-1 产生刺激作用［18］。同时PAI-1 可通过对纤维连接蛋白的降解产生抑制作用，进而造成纤维连接蛋白积聚，加重患者病情发展。本研究结果显示，AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态性表达与AECOPD 并发肺心病呈正相关性（P＜0.05），说明AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态性与AECOPD并发肺心病密切相关，究其原因可以发现，PAI-1 基因是位于转录起始位点上游675 b 位置上，有1 个鸟嘌呤插入缺失多态点4G/5G，插入型等位基因5G/5G纯合子的个体PAI-1 水平最低，缺失型等位基因纯合子4G/4G 个体的PAI-1 水平最高，而杂合子4G/5G基因的PAI-1 水平在二者之间［19］。其机制是缺失型和插入型等位基因都结合转录激活因子，而插入型等位基因还与一个抑制因子特异性结合，故PAI-1 水平升高可作为AECOPD 合并肺心病发生的一个指标。但PAI-1 基因多态性缺乏特异性，特别是高脂血症、高血压、糖尿病等疾病，也将造成其水平升高［20］。

综上所述，AT1R、ACE 及PAI-1 基因多态性表达与AECOPD 并发肺心病呈正相关性，可以作为临床诊断AECOPD 并发肺心病的靶向检测指标。与此同时，需对各种影响ACE、AT1R、PAI-1 基因多态性因素进行控制，以改善预后康复质量。