过表达lncRNA ASMTL-AS1 吸附miR-660 抑制肝癌细胞增殖的实验研究

金丽娟，杨 伟，张 娜，杨 俊，张爱芸

肝癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，也是中国癌症相关死亡的第二大原因［1］。尽管近年来在肝癌的治疗上采取了创新的治疗策略，但是其5 年生存率并没有得到显著提高［2］。以往研究证明，结构基因的异常表达与肿瘤的进展密切相关，也包括肝癌［3］。然而，在人类基因组中只有大约1%基因能够编码蛋白质，另有4%～9%的基因能够转录许多非编码mRNA，长度大于200 个碱基的非编码RNA 被称为长链非编码RNA（lncRNA）。据报道，lncRNA 可作为增强子，调控某些mRNA 的表达，也能够通过转录调节、转录因子捕获以及染色质重塑来调节顺式元件中的基因表达［4］。LncRNA 已被证明可以通过调节细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等多种生物学过程参与肿瘤的发生发展［5］。LncRNA ASMTLAS1（NR_026711.1）基因长度约2 000 bp，现已证明，其低表达与甲状腺癌的恶性表型有关，然而其在肝癌中的作用还未见详细报道［6］。本研究拟通过数据库分析以及体外研究初步探讨LncRNA ASMTLAS1 在肝癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 公共数据库资料收集：基于GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html） 分 析lncRNA ASMTL-AS1 在肝癌及癌旁组织中的表达情况。筛选条件：①Expression DIY；②Gene：ASMTL-AS1；③｜Log2FC｜Cutoff：1；④p-value Cutoff：0.05；⑤Datasets Selection：LIHC；⑥Log Scale：Yes；⑦Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。

1.2 主要试剂：Trizol RNA 提取试剂、miScript II RT Kit 反转录试剂盒以及双荧光素酶检测试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；SYBR Master Mix 购自天根生化科技（北京）有限公司；lncRNA ASMTLAS1 过表达载体以及Real-time PCR 检测引物委托上海吉马有限公司合成；Lipofectamine 2000 细胞转染试剂购自Invitrogen 公司；MTT 检测试剂购自碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶检测试剂盒购自Promega 公司。

1.3 细胞培养：人肝癌细胞系Huh-7、HB611、SMMC-7721 以及HepG2 细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。各细胞系复苏后加入含有10%胎牛血清以及1%双抗的高糖DMEM 培养液，置于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。隔天换液，待细胞长至铺满培养瓶时进行传代。

1.4 Real-time PCR：采用Trizol 试剂提取细胞的总RNA，将其稀释成50 μg/mL，使用特异性反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。用SYBR Green qPCR Mix 进行实时荧光定量PCR 反应，反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环。检测溶解曲线，分析各样本Ct 值，分别以GAPDH 或者U6 为内参，2-△△Ct法计算mRNA 的相对表达量。实验中所用引物序列见表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.5 细胞转染：待细胞长至70%～80%融合时进行细胞转染。按照1.5×104个细胞/孔的密度将接种于6 孔板中，采用Lipofectamine 2000 试剂进行转染，分别将空载体Vector 或者lncRNA ASMTL-AS1 过表达载体转染至SMMC-7721 细胞中，转染24 h 后Real-time PCR 检测lncRNA ASMTL-AS1 的表达验证过表达效率。

1.6 CCK-8 检测细胞增殖：将各组细胞按照2×103个细胞/孔的密度接种于96 孔细胞培养板，分别培养0 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 后，各孔加入100 μL的混合培养液，其中含有90 μL 的DMEM 完全培养液以及10 μL 的CCK-8 试剂培养细胞3 h。于标仪上测定各组细胞在450 nm 处的吸光度值。

1.7 双荧光素酶报告实验：采用ASMTL-AS1 的野生型载体（ASMTL-AS1-wt）或者其突变型载体（ASMTL-AS1-mut）分别与NC mimic 或者miR-660 mimic 共转染293T 细胞检测ASMTL-AS1 与miR-660 的结合情况。转染48 h 后采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞的荧光强度。

1.8 统计学方法：采用GraphPad 6.0 软件进行数据的统计分析。采用T-test 进行2 组间的比较，ANOVA 进行3 组及3 组以上的比较，P＜0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA ASMTL-AS1 在肝癌组织中的表达情况：利用GEPIA 网站分析了来自TCGA 和GTEx 项目的369 例肝癌样本以及160 例癌旁组织中lncRNA ASMTL-AS1 的表达情况，结果显示在肝癌组织中lncRNA ASMTL-AS1 的表达水平显著低于癌旁组织（图1），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 肝癌组织中 lncRNAASMTL-AS1 的表达

2.2 lncRNA ASMTL-AS1 在肝癌细胞中的表达检测：Real-time PCR 检测了四株肝癌细胞中lncRNA ASMTL-AS1 的表达，结果显示肝癌细胞株SMMC-7721 细胞中lncRNA ASMTL-AS1 的表达最低（图2A），因此，选择SMMC-7721 细胞进行后续实验。在SMMC-7721 细胞中转染lncRNA ASMTLAS1 过表达载体，48 h 后采用Real-time PCR 检测lncRNA ASMTL-AS1 的表达。结果显示，lncRNA ASMTL-AS1 的表达显著高于空载体转染的细胞，差异具有统计学意义（图2B，0.91±0.12 vs.9.01±0.72，P＜0.05）。

图2 lncRNAASMTL-AS1 在肝癌细胞中的表达

2.3 lncRNA ASMTL-AS1 对肝癌细胞增殖的影响：分别于转染lncRNA ASMTL-AS1 过表达载体后的不同时间点采用CCK-8 检测细胞的增殖情况。结果显示转染24 h、48 h、72 h、96 h 后细胞的增殖能力显著低于空载体转染组，差异具有统计学意义（图3，P＜0.05）。

图3 细胞增殖检测

2.4 lncRNA ASMTL-AS1 和miR-660 的结果情况：预测显示，lncRNA ASMTL-AS1 上存在有miR-660的结合位点，因此，我们采用双荧光素酶检测了两者的结合情况。结果显示，野生型lncRNA ASMTLAS1 与miR-660 mimic 共转染的细胞中双荧光素酶的活性显著低于其他各组，差异具有统计学意义（图4，P＜0.05）。

图4 双荧光素酶检测lncRNAASMTL-AS1 和miR-660 的结合

2.5 lncRNA ASMTL-AS1 对miR-660 及其下游靶基因表达的影响：Real-time PCR 检测miR-660 的表达，结果显示转染lncRNA ASMTL-AS1 过表达载体后SMMC-7721 细胞中miR-660 的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（图5A，P＜0.05）。同时检测miR-660 下游靶基因FOXO1 的表达，结果显示，转染lncRNA ASMTL-AS1 过表达载体后细胞中FOXO1 的表达水显著上调（图5B）。这些结果表明，上调lncRNA ASMTL-AS1 能够抑制miR-660 的表达，进而上调其下游靶基因FOXO1 的水平。

图5 miR-660 以及其靶基因FOXO1 的表达

3 讨论

LncRNA 能够通过对编码RNA 的转录及表达进行调控参与细胞的多种生物学行为，因此，LncRNA的异常表达与肿瘤的进展也密切相关［6］。新近，Feng等［6］在甲状腺癌细胞中证明，lncRNA ASMTL-AS1 在甲状腺癌组织中的表达水平显著降低，并且其低表达与肿瘤大小、转移以及预后不良密切相关，此外，过表达lncRNA ASMTL-AS1 显著抑制了甲状腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，同时诱导了甲状腺癌细胞的凋亡。本研究利用GEPIA 网站分析了来自TCGA和GTEx 项目的369 例肝癌组织以及160 例癌旁组织中lncRNA ASMTL-AS1 的表达情况，结果显示，lncRNA ASMTL-AS1 在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，提示lncRNA ASMTL-AS1 的表达可能与肝癌的发生发展有关。失去增殖的限制是肿瘤细胞最典型的特征之一，因此我们进一步在肝癌细胞SMMC-7721 细胞中过表达lncRNA ASMTLAS1，观察其对肝癌细胞增殖的影响，发现过表达lncRNA ASMTL-AS1 后细胞增殖能力显示受到抑制。这些结果提示，上调lncRNA ASMTL-AS1 可作为控制肝癌细胞异常增殖的潜在策略。

LncRNA 调控编码基因的表达方式多种多样，新近的研究发现，LncRNA 可以通过miRNA 调控原件特异性结合并吸附miRNA，进而调控miRNA 的表达，从而影响miRNA 对其下游靶基因的调控［8］。miR-660-5p 也被简称为miR-660，目前被证明为一个促肿瘤的miRNA。抑制miR-660 的表达能够抑制乳腺癌的增殖及转移［9］。转染了miR-660 inhibitor的肾癌细胞增殖能力显著降低并且细胞的凋亡率显著升高［10］。我们的研究发现lncRNA ASMTL-AS1 能够通过miR-660 的调控原件特异性的结合miR-660，并且在肝癌细胞中过表达lncRNA ASMTL-AS1后miR-660 的表达水平显著降低，因此，我们推测，上调lncRNA ASMTL-AS1 可能通过吸附促肿瘤的miR-660 从而抑制其活性而抑制了肝癌细胞的增殖。

FOXO1 是叉头盒基因家族的关键成员，在肿瘤发生、发展和转移过程中调节多种细胞功能［11］。更重要的是，多项研究指出，FOXO1 能够促进肝癌的进展［12-13］。此外，Zhang 等［14］在骨肉瘤细胞中证明，miR-660 能够靶向调控FOXO1，抑制miR-660后FOXO1 得到释放从而抑制了骨肉瘤细胞的增殖。本研究发现在肝癌细胞中过表达lncRNA ASMTLAS1 后，miR-660 表达水平降低而FOXO1 的表达显著升高，因此我们推测，lncRNA ASMTL-AS1 可能通过吸附miR-660 而上调了细胞中FOXO1 的水平，从而抑制了肝癌细胞的增殖。

综上所述，lncRNA ASMTL-AS1 在肝癌组织中表达升高，上调lncRNA ASMTL-AS1 能够抑制肝癌细胞的增殖。这种作用可能与其吸附miR-660 从而促进FOXO1 的表达有关。本研究为肝癌的治疗提供了更多的实验依据。