长江口海域夏季鱼卵、仔稚鱼种类组成及多样性连续观测

张 格，郑连明，2，何浩阳，林 华，詹肖茜，李克景

(1.厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102；2.厦门大学海洋生物多样性与全球变化研究中心，福建 厦门 361102)

长江口是我国众多水生生物重要的栖息、繁衍所在地，内接长江，外连东海，是一个相对独立的半咸水水系，其邻近水域鱼类及其补充群体具有复杂性和多样性[1-2]。鱼类早期个体(包括鱼卵和仔稚鱼)的种类分布及数量变化是评估海域鱼类产卵场、亲鱼资源量、渔业资源补充量最直接有效的数据资料，但有研究表明长江口鱼卵、仔稚鱼群落发生变化，经济鱼类补充群体有所下降[3-5]。长江口及其邻近海域鱼卵、仔稚鱼多样性研究已有较好的基础和数据积累[6-8]，但多数研究是基于传统形态分类所得的结果，多数鱼卵只能鉴定到属或科的水平，部分仔稚鱼无法鉴定到种。

DNA条形编码(DNA barcoding)是一种基于分子生物学技术进行物种鉴定的新方法。Hebert等[9]对11个门的13 320个物种进行COI基因序列分析后认为其能很好地区分研究物种。DNA条形码技术在鱼类浮游生物中的应用将成为形态鉴定强有力的补充，弥补传统鱼卵、仔稚鱼研究的不足[10-12]。近年来，利用线粒体基因序列比对进行的鱼类浮游生物的鉴定已经取得了一定的进展，例如：Lin等[13]利用DNA条形码研究了东海鱼类浮游生物群落结构与长江冲淡水和黑潮等水团的关系。以往大部分长江口鱼卵、仔稚鱼研究是关于种类组成、分布格局及其影响因素，关于潮汐作用的影响研究甚少，本研究利用2017年在长江口海域设置的两个连续观测站采得的鱼卵、仔稚鱼，结合形态学及DNA条形码数据对鱼类浮游生物的种类和丰度进行分析，探讨了其与潮汐之间的关系，同时探讨了DNA条形码在鱼卵、仔稚鱼鉴定中的可行性，旨在为长江口鱼类浮游生物多样性及渔业资源调查提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集与形态学鉴定

本研究于2017年7月16日至2017年7月21日在长江口海域设置2个连续站L1(31°12′07″N、122° 48′15″ E)、L4(31° 12′06″ N、122° 59′53″ E)进行24 h连续观测(图1)，每3 h用海水大型浮游生物网(网口直径80 cm、网长280 cm、孔径0.505 mm)由底至表进行鱼类浮游生物垂直采样，采集的样品先用中性甲醛溶液固定，3 h后转入无水乙醇中并低温保存。同步采集的环境要素，包括水温、盐度、溶解氧等。样品的采集，保存和室内分析均按照《海洋调查规范》(GB/T 12763.6—2007)中规定的方法进行[14]。样品参考《中国近海及其邻近海域鱼卵与仔稚鱼》《台湾海域鱼卵图鉴》在室内体视显微镜下依据形态特征进行分拣[12，15]，根据初步鉴定结果，选取具有代表性个体采集图像后进行DNA条形码分析。

1.2 DNA条形码序列获取

样品图像采集后，立即用双蒸水进行清洗。仔稚鱼取尾部或背部肌肉2～25 mg，鱼卵用完整单个鱼卵，利用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0按照说明书进行样品的DNA提取。选取全球鱼类基因条码计划(Fish-BOL)中DNA条形码标准基因COI作为此次研究的条形码基因，扩增采用扩增鱼类COI的引物fishCOI[16](Fish F1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’；Fish R1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’)，反应体系为50 μL，包含5.0 μL 10×buffer，0.8 μL dNTP(2.5 mmol/L)，正反引物各0.5 μL(50 μmol/L)，0.3 μLTaq酶，DNA模板5 μL，其余用超纯水补足。反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性60 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物纯化后送上海生工测序。

1.3 序列分析及数据处理

利用Chromas 2.33软件对获得的序列进行自检，确定COI基因序列的有效片段长度及准确性并用seqman 7.1.0进行序列拼接；将确定有效的COI基因序列在国际基因库GenBank数据库和Bold System(Barcode of Life Data System)数据库中进行BLAST比对分析，以确定相似种。结果均按照《拉汉世界鱼类名典》和台湾鱼类资料库进行同种异名的校正[17]。利用origin 2018画图。

2 结果

2.1 分子鉴定结果

在L1站位共采得鱼卵19枚，仔稚鱼201尾；L4站位共采集鱼卵17枚，仔稚鱼92尾。本研究选取75个鱼卵、仔稚鱼样品进行DNA提取、PCR扩增及测序，最终得到鱼卵、仔稚鱼的COI序列共70条，另有5个鱼卵样品由于可提取的组织过少或DNA降解等原因，使其COI序列扩增失败。经过Bold和Genbank比对，并结合形态特征分析共鉴定出26个分类单元，隶属于8目15科20属，其中6个鉴定到科，1个鉴定到属，19个鉴定到种(表1)。

表1 物种名称、分类地位

续表1

注：标“+”为在该站位出现，“-”为未出现。

Note：Mark“+”appeared in the station，“-”didn’t appear.

基于K2P模型计算各分类阶元的遗传距离(表2)。种内遗传距离分布在0～0.017之间，平均为0.007；由于样品较少，鉴定出的结果基本上1属内只含1个种类，仅舌鳎属中包含3个种类，属内种间遗传距离最小为0.216，最大为0.254，平均遗传距离为0.229；同科属间遗传距离最大值为0.313，最小值为0.134，平均值为0.225；同目科间的遗传距离最小值为0.198，最大值为0.339，平均值为0.268；除同属种间遗传距离由于数据较少引起一定偏差外，遗传距离基本上是随着分类阶元的的提高而增大的。

表2 不同分类阶元遗传距离(K2P)统计表

2.2 物种多样性比较

L1站位鱼卵、仔稚鱼共14种，其中，鱼叚虎鱼科种类与数量最多，共5种，占总数的71.7%。L1站位物种数在16日的9：00最多，鱼卵仔稚鱼共7种，随后采集到的种类数呈下降趋势，18：45之后收集到的样品种类数较少，均为4种；L4站位共21种，鱼叚虎鱼科种类最多，共5种，舌鳎科数量最多，占总数的28.8%。L4站位的种类数在20日21：00达到最大，共10种，随后采集到的种类数呈下降趋势，次日12：00最小，共3种。远岸站L4总体上物种数与物种丰富度高于近岸站L1(图2)。

2.3 潮汐对鱼卵、仔稚鱼丰度的影响

2.3.1 潮汐对鱼卵、仔稚鱼总丰度的影响

两个站位丰度随潮汐变化不尽相同。近岸站L1站位鱼卵、仔稚鱼各时间点总丰度变化范围为0.45～2.80 ind/m3，平均丰度为0.98 ind/m3。在16日落潮时18：45有一个丰度高值，其他时间段丰度变化较小；种类组成上，L1站位每个时间点均有拉式狼牙鱼叚虎鱼(Odontamblyopuslacepedii)出现，鱼叚虎鱼科丰度占据绝对优势，对于L1站位各时间点丰度的贡献率为21%～85%，丰度高值点主要是由于鱼叚虎鱼科种类的迅速增加所贡献(图3)。远岸站L4站位各时间点总丰度变化范围为0.13～0.88 ind/m3，平均丰度为0.38 ind/m3。总丰度在20日的21：00达到最大，为0.88 ind/m3，在21日9点总丰度最小，为0.13 ind/m3；丰度与涨落潮的关系相比L1站位不明显；L4站位并没有种类占据绝对优势，各时间点出现的较为优势的种类都不相同(图4)。相比远岸站L4，近岸的L1站位拥有较高的丰度和较低的的物种丰富度。

2.3.2 潮汐对不同生态习性鱼卵、仔稚鱼的影响

根据《浙江海洋鱼类志》对鱼卵、仔稚鱼所对应鱼类生态类群进行划分[18]。

1)底栖鱼类

底栖仔稚鱼以鱼叚虎鱼科为代表。在L1站位，鱼叚虎鱼科丰度主要由拉式狼牙鱼叚虎鱼贡献，其总丰度在9：00低潮时有一个丰度的上升，在16：00-18：00落潮时丰度有一个明显的高值(图5a)；L4站位总丰度也有相似的规律，在20日21：00-0：00落潮时有一个丰度的高值，且出现更多的鱼叚虎鱼种类；在15：00低潮时，丰度略微上升。L4站位的平均丰度远小于L1站位，且鱼叚虎鱼科种类组成差异并不显著(图5b)。

注：A：黏皮鱼甾鱼叚虎鱼Mugilogobiusmyxodermus；B：孔鱼叚虎鱼Trypauchenvagina；C：弹涂鱼Periophthalmusmodestus；D：拉式狼牙鱼叚虎鱼Odontamblyopuslacepedii；E：鱼叚虎鱼科sp.1 Gobiidae sp.1；F：鱼叚虎鱼科sp.2 Gobiidae sp.2；G：鱼叚虎鱼科sp.3 Gobiidae sp.3；H：多须拟矛尾鱼叚虎鱼Parachaeturichthyspolynema。

2)底层鱼类

底层仔稚鱼以舌鳎科(Cynoglossidae)、灯笼鱼科(Myctophidae)的七星底灯鱼(Benthosemapterotum)及发光鲷科(Acropomatidae)的日本发光鲷(Acropomajaponicum)为代表。舌鳎科丰度随潮汐变化较大，16日至17日高、低潮时L1站位的焦氏舌鰨(Cynoglossusjoyneri)丰度较低，而涨潮与落潮时丰度有所上升，16日16：00高潮前后均出现一个丰度的高值，17日3：00高潮前也出现丰度的一个小高值(图6a)；在L4站位，涨潮时舌鳎科丰度有所上升(图6b)。灯笼鱼科在L1站位的出现频率明显小于L4站位，仅在17日21：00低潮时出现(图7a)；在L4站位丰度较高，于20日21：00落潮起至21日3：00低潮时丰度较高，其他时间点没有出现或丰度较低(图7b)。发光鲷科仅在L4站位20日高潮时采集到1尾(图8)。

注：A：焦氏舌鳎Cynoglossusjoyneri；B：舌鳎属Cynoglossussp.。

3)中、下层鱼类

中、下层鱼类以石首鱼科(Sciaenidae)为代表。石首鱼科在L1站位丰度高于L4站位，在L1站位分别在16日16：00高潮时和17日3：00高潮时有一个丰度的高值，其中石首鱼科sp.与黄姑鱼(Nibeaalbiflora)丰度在涨潮时明显上升，而银姑鱼(Pennahiaargentata)出现频率较小，仅在16日落潮时发现(图9a)；L4站位石首鱼科出现频率小于L1站位，总丰度在20日高潮与0：00落潮时较高，21日9：00高潮时出现丰度的高值(图9b)，其中石首鱼科sp.与黄姑鱼在落潮时丰度有所升高，而银姑鱼则在21日0：00落潮时以及21日9：00高潮时采集到。

4)中、上层鱼类

中、上层鱼类以日本鳀(Engraulisjaponicus)及犀鳕科(Bregmacerotidae)为代表。日本鳀只在L4站位3：00低潮时采集到2尾(图10)。犀鳕科仅在L4站位采集到，涨潮时丰度相比落潮时要高(图11)。

注：A：黄姑鱼Nibeaalbiflora；B：石首鱼科Sciaenidae sp.；C：银姑鱼Pennahiaargentata。

5)鱼卵

鱼卵缺少自主行动的能力，只能随水流漂流运动，鱼卵随潮汐的变化并不明显，在L1站位16日9：00低潮至21：00低潮都有鱼卵采集到，其中16：00高潮时丰度最高(图12a)；L4站位从20日3：00低潮至21日15：00低潮都有鱼卵采集到，在21日6：00丰度最高(图12b)。L4站位的鱼卵种类组成明显高于L1站位，其丰富度高于L1站位。

注：A：单指虎鲉Minousmonodactylus；B：龙头鱼Harpadonnehereus；C：石首鱼科Sciaenidae sp.；D：断线舌鳎Cynoglossusinterruptus；E：焦氏舌鳎Cynoglossusjoyneri；F：高鳍带鱼Trichiuruslepturus；G：少鳞鱚Sillagojaponica；H：虻鲉Erisphexpottii。

3 讨论

3.1 COI条形码进行鱼卵、仔稚鱼鉴定的适用性和局限性

物种的准确鉴定是鱼类浮游生物多样性与生态学研究长期以来的瓶颈。目前已鉴别的成鱼种类超过28 700余种，但能够鉴别的仔稚鱼种类仅占成鱼种类的1/10，而鱼卵则不到成鱼种类的1/10[12]。DNA条形码技术已经在海洋生物多样性研究中得到广泛应用[19]。本研究比较各分类阶元的遗传距离，种内遗传距离为0.007，远小于同属种间遗传距离0.229，表明COI序列间的差异能够很好地区分各种鱼卵、仔稚鱼。当然，由于鱼类浮游生物特别是鱼卵可供甄别的形态特征较少，其物种的准确鉴定很大程度上依赖DNA条形码序列的比对结果，因此数据库的完整性与可靠性对鉴定结果的准确性至关重要。本研究中，鱼叚虎鱼科sp.1(Gobiidae sp.)在NCBI的Genbank数据库和Bold系统中比对结果与小头副孔鱼叚虎鱼(Paratrypauchenmicrocephalus)及弹涂鱼(Periophthalmusmodestus)相似度最高，但均仅达到92.41%左右，由于结果中匹配度最高的两种分属于不同属，故只将样品鉴定到科的水平；鱼叚虎鱼科sp.2在Genbank数据库中与巴布亚沟鱼叚虎鱼(Oxyurichthyspapuensis)相似度最大，为90.91%，在Bold系统中匹配度最高的序列也仅定到鱼叚虎鱼科，故也鉴定至科；鱼叚虎鱼科sp.3在Genbank数据库中最大相似度为87.6%，在Bold系统中虽然与钝孔鱼叚虎鱼属(Amblyotrypauchensp.)相似度为100%，猜测样品属于钝孔鱼叚虎鱼属，但Bold系统中该序列未公开发表，故仍只将其鉴定到科；另外，鱼叚虎鱼科有1条序列在两个数据库与尾斑舌塘鳢(Parioglossusdotui)相似度达100%，与弹涂鱼相似度达99.8%，与张顺等[20]研究情况相似，鉴于后者在调查海域分布情况较为常见，故将其鉴定为弹涂鱼。此外，有12条序列与两个数据库中的焦氏舌鳎(Cynoglossusjoyneri)和长吻舌鳎(Cynoglossuslighti)相似度在99%～100%，参考宋超等[21]基于长江口部分舌鳎科(Cynoglossidae)COI基因的研究，长江口的长吻舌鳎和焦氏舌鳎遗传距离为0.007，可能属于同种异名，故将其统一鉴定为焦氏舌鳎；舌鳎属序列在两个数据库中与紫斑舌鳎(Cynoglossuspurpureomaculatus)和宽体舌鳎(Cynoglossusrobustus)相似度都达到100%，且二者在该海域均有分布记录，猜测其也存在同种异名的可能，为慎重起见，将其鉴定至属；6条序列在两个数据库中，与大黄鱼(Larimichthyscrocea)、皮氏叫姑鱼(Johniusbelangerii)及钝头叫姑鱼(Johniusamblycephalus)相似度均达到100%，鉴于大黄鱼与皮氏叫姑鱼在长江口春、夏季都有出现[22]，故只将其鉴定到科；鳚科1条序列在Genbank数据库中与短头跳岩鳚(Petroscirtesbreviceps)和变色跳岩鳚(Petroscirtesvariabilis)达99%以上，在Bold系统中与黑带稀棘鳚(Meiacanthusatrodorsalis)相似度为100%，故将其鉴定到科。本研究通过条形码鉴定出的斑点肩鳃鳚仔鱼在长江口是首次记录。徐春燕等[23]曾基于COI基因报道了33种仔稚鱼的DNA条形码分析，其中包括了斑点肩鳃鳚的基因序列；斑点肩鳃鳚分布于印度-太平洋区，从台湾北至日本均有分布，但由于其非经济鱼类，过去基于形态学有将其鉴定错误的可能，另外，也有斑点肩鳃鳚鱼卵随水流漂至长江口发育成仔稚鱼的可能。

然而，COI基因并非适用于所有鱼类的鉴别，某些特定的鱼种如鱼喜属(Sillago)、石斑鱼科[19]鱼类容易发生杂交现象，仅凭COI基因很难将其鉴定正确，需要与其他基因联合标记加以鉴别；此外，由于数据库的不完整，某些鱼类仅有16S和12S片段，COI基因尚不能将样品鉴定至种，对于某些近缘种，需要结合形态学、分子遗传学及地理学才能对其分类并更准确地定位[24]。尽管有上述不足，DNA条形码因准确性较高、操作简单，已成为传统形态学有力的补充。目前，全球鱼类基因条形码计划(Fish-BOL)已启动，我国也加入其中，成鱼基因资料库的不断完善，势必推动DNA条形码在鱼类浮游生物鉴定中的应用。

3.2 潮汐对鱼类浮游生物的影响

鱼卵不具备活动能力，仔稚鱼虽然有一定的游泳能力，但游泳能力较弱，二者基本上随水流漂流生活[25]。潮汐在接近河口时变化非常显著，涨落潮等大尺度的海水运动必然携带海水中的鱼卵和仔稚鱼进行移动。本研究中，L1和L4站位各时间点间的物种更替率大都超过60%，潮水运动对长江口鱼类浮游物种组成影响较大，说明开展河口海域鱼类浮游生物多样性研究必然考虑到潮汐效应。近岸站位L1所采集到的种类数少于远岸站L4站位，这与万瑞景等[26]的研究中鱼卵、仔稚鱼多样性在外海高于近海的研究结果相似；L1站位的丰度相比L4站位却高得多，这是因为河口区的环境变化较为剧烈，能在此栖息的种类多数具有较好的环境承受能力和可塑性，因此近河口区域鱼类浮游生物拥有较高丰度的优势种和众多的稀有种[27-28]。本研究对比潮高和鱼卵、仔稚鱼种类数和丰度，发现潮水的涨落对鱼卵、仔稚鱼的种类数影响并不明显，但对丰度的影响较大。L1站位的丰度总体呈现一种涨潮时降低，落潮时升高的趋势，而L4站位总丰度随潮高变化不明显。依照生态类群对L1、L4站位的鱼卵仔稚鱼丰度进行比较后发现：栖息于咸淡水交汇处的底栖鱼类的鱼叚虎鱼科在落潮时丰度升高，可能是落潮时冲淡水将栖息在河口区较高丰度的鱼叚虎鱼带到了口门外及较靠外海处，鱼叚虎鱼科对更靠河口的近岸站L1站位丰度贡献较大，导致L1站位在落潮时丰度上升较为明显，而远岸站L4在落潮时鱼叚虎鱼科丰度也有所上升。底层鱼类仔稚鱼种类较多，其中舌鳎科在L1站位丰度较高，其丰度与潮汐关系不明显，但无论在L1站位还是L4站位，都在高潮前有一个丰度的提高，可推测舌鳎科在该海域分布较为广泛，涨潮时游泳能力较弱的仔稚鱼有随潮流向近岸移动的趋势，分布较为集中，密度较大[29]；灯笼鱼科的七星底灯鱼倾向于分布在高盐水体[30-32]，其在两个站位均有出现，且在落潮和低潮时丰度较高，可推测其幼年时期集中在长江口附近发育，密度较为集中，落潮时由冲淡水携带到调查站位，这与单秀娟等[27]发现的七星底灯鱼幼体主要分布在长江冲淡水与外海水交汇区结果相一致。发光鲷科L4站位出现，呈现涨潮时丰度升高的趋势，可能是涨潮时随外海高盐水团到达调查站位。中、下层鱼类主要为石首鱼科，石首鱼科在两个站位的丰度变化较为接近，均在高潮时表现出较高的丰度，石首鱼科sp.与黄姑鱼在涨潮时丰度明显上升，可能是石首鱼科sp.与黄姑鱼分布中心更倾向于深水区和高盐水体[30]，在长江口外沿岸分布较广，涨潮时将较靠外海的个体携带至调查站位；而同科的银姑鱼在夏季偏好盐度低的水域[31]，因而落潮时出现频率要高于涨潮时。中、上层鱼类以日本鳀和犀鳕科为主，日本鳀仅在L4站位落潮时采集到，日本鳀早期阶段适应温盐较广，且长江口一直以来都是鳀、小公鱼等经济鱼类的育幼场，王小谷等[30]的研究表明夏季长江口鳀鱼密集区域是长江口内，因此本文中落潮时鳀鱼丰度升高可能是集中于长江口某处的日本鳀鱼群随潮流到达调查站位；犀鳕科在L4站位出现，呈现涨潮时丰度升高的趋势，极可能是涨潮时随外海高盐水团到达调查站位。