杠板归槲皮素提取工艺优化及体外抑菌效果

唐远江 杨粤黔 周思璇 张涛 卢昱希 黄炳香

摘要：为优化杠板归中槲皮素的最佳提取工艺，检验提取物体外抑菌活性，以槲皮素提取量为评价指标，采用Plackett-BurnmanDesign（PBD）设计联合Box-BehnkenDesign（BBD）对槲皮素的提取工艺进行考察，并采用微量肉汤二倍稀释法和琼脂平板培养计数法研究提取物和槲皮素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌和杀菌作用。结果可知，最佳提取工艺为加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取时间3.4h，提取2次。提取物对3株细菌的最小抑菌浓度（MIC）介于3.12～6.31g/L，最小杀菌浓度（MBC）介于12.52～25.41g/L，槲皮素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌MIC分别为7.11、3.16g/L，MBC分别为100.18、50.56g/L，其杀菌效果不如提取物，对沙门氏菌的MIC和MBC均为3.27g/L，殺菌效果优于提取物。优化后的提取工艺稳定合理，且提取物具有良好抑菌活性。

关键词：杠板归;槲皮素;PBD;BBD;MIC;MBC

中图分类号：R284.2文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）22-0207-06

作者简介：唐远江（1987—），男，贵州遵义人，硕士，研究实习员，主要从事中兽药研发。E-mail：tangyjjay0909@126.com。

通信作者：杨粤黔，副研究员，主要从事中兽药研发。E-mail：252184152@qq.com。

杠板归为蓼科蓼属植物杠板归（PolygonumperfoliatumL.）的全草，民间习称蛇倒退、猫爪刺、杠板归等[1]，其主要成分有黄酮类、有机酸类、萜类等[2-6]。《中国兽药典》2015版第二部中规定，槲皮素为杠板归的主要成分[7]。现代药理学研究表明，杠板归具有抗菌、抗病毒、降血压、抗肿瘤等作用[8-10]，临床上杠板归常用于治疗慢性湿疹、乳腺炎、百日咳、泻痢、黄疸、跌打肿痛等疾病。杠板归的煎煮剂对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、炭疽杆菌等均有较强抑制作用，乙酸乙酯、正丁醇提取物对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，75%乙醇提取物对多种细菌具有广谱抗菌性[11-12]。槲皮素具有广谱抗菌性，并且对革兰氏阴性菌的抗菌作用强于革兰氏阳性菌[13]。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌是引起畜禽细菌性疾病的常见致病菌[14-17]。因致病性细菌血清型众多，难以制备出具有针对性的疫苗[18]。抗生素是治疗此类疾病有效的手段，但长期使用抗生素导致致病菌的耐药性严重，研究表明，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌对多种抗生素具有耐药作用[19]。抗生素残留可导致致病菌的耐药性增强并转移给人类，引起动物内源性感染和二重感染，使动物免疫力降低，抗原质量降低，降低疫苗的使用效果。寻找抗生素替代物和新途径，消除或减轻禁用抗生素带来的一系列影响，是我国畜牧业急需解决的问题[20]。

相比抗生素，中兽药具有无残留、不易产生耐药性、价格便宜等优点，在畜牧养殖中的作用日趋重要[21]。2020年，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料，使得中兽药的发展迎来重大契机。前期研究发现，杠板归汁液对大肠杆菌具有良好的抑菌活性，但未对其提取液进行研究。虽然杠板归在临床上的应用研究较多，但其有效成分的提取优化以及在兽医上的开发应用较少。因此，为拓展中药杠板归的运用，笔者运用Plackett-BurnmanDesign（PBD）和Box-BehnkenDesign法（BBD）设计，优化建立杠板归中槲皮素的提取工艺，并检验提取物的抗菌活性，以期为该中药的开发和利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

供试菌株，大肠杆菌ATCC25922标准株、沙门氏菌ATCC13076标准株、金黄色葡萄球菌ATCC6538标准株，均由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室保存;杠板归分析样品，由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室提供，经贵州省畜牧兽医研究所尚杨粤黔鉴定为PolygonumperfoliatumL.。槲皮素对照品，购于中国食品药品检定研究院，批号110957—201808;水解酪蛋白肉汤（MHbroth）和水解酪蛋白琼脂（MHagar），购自广州环凯微生物科技有限公司。其他试剂为色谱纯或分析纯。

1.2主要设备与仪器

LC-20型岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司）、HH-4数显恒温水浴锅（成都美普达仪器有限公司）、BSA224S型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、洁拓超声波清洗仪（深圳市洁拓超声清洗设备有限公司）、DHG-9240A电热恒温干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、RE-5205型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3试验方法

1.3.1槲皮素的定量检测方法[7]

（1）色谱条件，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）为流动相;检测波长为360nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量10μL。

（2）对照品溶液的制备，取槲皮素对照品适量，精确称定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备，取本品粉末（过三号筛）约0.7g，精确称定，置于具塞锥形瓶中，精确加入甲醇-盐酸（4∶1）混合溶液50mL，称定质量，置90℃水浴中加热回流1h，放冷，再称定质量，采用甲醇补足减失的质量，摇匀、滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

（4）线性关系考察，精确称取槲皮素对照品16.05mg置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别吸取对照品溶液1.6、3.2、7.8、12.5、17.2mL于50mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得对照品质量浓度分别为10.00、20.50、50.00、80.02、110.40μg/mL，分别取各质量浓度标准品溶液10μL进样，记录色谱图峰面积。以峰面积值（y）对对照品质量浓度（x）进行回归，绘制标准曲线方程。

（5）精密度试验，精确吸取槲皮素对照品溶液（20.50μg/mL）10μL，按上述色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。

（6）稳定性试验，取供试品溶液，于制备后0、1、2、4、8、12h分别进样10μL，计算峰面积的RSD。

（7）重现性试验，取杠板归药材6份，制备样品供试品溶液，取供试品溶液进样10μL检测，计算槲皮素含量。

（8）加样回收试验，取已知含量（0.32mg/g）的样品0.5g，共6份，精确称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入槲皮素对照品溶液（20.50μg/mL）5mL，制备样品供试品溶液，进行测定，以供试品溶液中对照品绝对质量分数计算加样回收率。

1.3.2PBD筛选主要因素

取10g杠板归采用水浴回流提取，取滤液检测槲皮素含量，运用Minitab19进行PBD试验。考察各个因素对槲皮素提取量的影响，试验对A（浸泡时间）、B（乙醇体积分数）、C（溶剂量）、D（温度）、E（提取时间）、F（提取次数）等6个主要因素进行评价，根据预试验结果确定每个因素高（代码：1）、低（代码：-1）2个水平共12组试验，筛选对槲皮素提取量的影响主要因子。PBD试验因素和水平见表1。

1.3.3BBD试验优化提取工艺

取10g杠板归采用水浴回流进行提取，根据PBD试验结果，以槲皮素含量（y）为目标响应值，选取乙醇体积分数（x1）、溶剂量（x2）和提取时间（x3）设计3因素3水平的响应面分析试验，响应因素水平见表2。

1.3.4中药提取物制备

称取杠板归中草药200g粉末，采用优化后的工艺提取，合并提取液，过滤，烘干并粉碎，采用10%甲醇溶解并稀释成不同浓度的溶液，相同方法配制槲皮素溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用。

1.3.5菌液制备

将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于含MH液体培养基的试管中，置于37℃、200r/min条件下培养12h，并采用液体培养基将菌液的D600nm调整为0.8，再用培养基稀释1000倍，相当于菌液浓度为105～106CFU/mL，保存备用。

1.3.6最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量肉汤二倍稀释法，于无菌96孔板每一孔中均加入100μL肉汤，再分别向第一孔中加入100μL配备好的药液，混匀后依次倍比稀释，直到最后一孔混匀后弃去100μL混合液。每孔加入配备好的100μL细菌稀释液，同时设置阳性对照组（加菌不加药）和阴性对照组（不加菌不加药）。在正式试验之前设置有机溶剂对照组，即对每株菌进行有机溶剂的对照试验，将药液换成甲醇，保证所有供试菌株存活的最大溶剂含量，以便制备药液所用的溶剂含量远低于此值。将供试菌株37℃恒温培养24h后取出，观察细菌生长情况。每组试验至少重复3次。

采用TTC法对MIC结果进行判定。向上述培养24h后的96孔板每孔分别加入20μL0.5%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃避光培养2h，观察菌液的颜色变化。试验组眼观溶液澄清、颜色未发生变化的最低药物质量浓度则作为该药的MIC。

1.3.7最小杀菌浓度（MBC）的测定

将上述试验组澄清的各孔中液体取100μL涂布于相应的营养培养基上，于37℃培养48h，以肉眼观察无菌落生长的最低药物质量浓度为其MBC[19]。

2结果与分析

2.1槲皮素定量检测试验的可靠性

线性关系试验得出标准曲线方程为y=4×107x-35941，r2=0.9996，进样浓度在10.00～110.40μg/mL，表明进样浓度和峰面积线性关系良好。槲皮素对照样品和检测样品的HPLC色谱图见图1。精密度试验得出对照品平均峰面积为674579.33，RSD<2%，说明仪器精密性良好。稳定性试验表明，槲皮素色谱峰面积RSD值为1.56%，样品供试液在12h内稳定性良好。重现性试验得出杠板归样品平均含量为0.31mg/g，RSD<2%，表明该样品处理方法重现性好。加样回收试验表明，槲皮素平均回收率为99.73%，RSD为0.98%，说明本方法可靠、准确度好，符合含量测定的要求。

2.2影响杠板归提取工艺的主要因素

按照PBD试验设计，得到各处理组的槲皮素提取量（表3）。运用Minitab19软件对各个因素进行显著性分析，由表4可知，乙醇体积分数、溶剂量、提取时间对槲皮素提取量的影响显著，浸泡时间、提取次数、温度的影响不显著。因此，选取乙醇体积分数、溶剂量、提取时间进行BBD试验设计。

2.3槲皮素提取工艺回归模型的建立

根据BBD试验设计，得到不同水平条件下槲皮素的提取量（表5）。运用Designexpert10.3.2软件，以槲皮素含量（y）为响应值分别对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，得到y对x1、x2和x3的二次多项回归方程：y=0.322-0.0025x1+0.0001x2+0.015x3+0.0075x1x2-0.0075x1x3+0.0125x2x3-0.0322x21-0.0022x22-0.0173x23。模型F值为3.18，P<0.05，响应回归模型显著，失拟项P>0.05，失拟不显著，由表6可知，根据模型拟合规律[22]，说明该回归模型拟合程度较好。

2.4槲皮素最佳提取工艺的建立

以x1、x2、x3中任意1个变量固定，其余2个变量对y值作响应面图（图2）。根据曲面图分析原理[23]，可以看出x1和x3对y值的交互作用不显著，x1和x2，x2和x3对y值的交互作用明显，根据回归模型和曲面分析，得到槲皮素的最佳提取工艺为：加25倍59.92%體积分数乙醇，60℃下回流提取时间3.4h，提取2次，预测值y=0.33mg/g。

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2.5最佳提取工艺的验证

取杠板归适量，加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取3.4h，提取2次，按此工艺参数进行3次平行试验，得到槲皮素平均提取量为0.34mg/g，由表7可知，槲皮素提取量与预测值相近，说明建立的提取工艺具有良好的可信度。

2.6杠板归提取物和槲皮素的抑菌活性

由表8可知，杠板归提取物和槲皮素对3株细菌均有抑制作用。提取物对3株细菌的MIC分别为3.12、6.24、6.31g/L，MBC分别为12.52、24.08、25.41g/L，槲皮素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为7.11、3.16g/L，MBC分别为100.18、50.56g/L，与杠板归提取物的杀菌活性相比，槲皮素单体的杀菌效果不如提取物。槲皮素对沙门氏菌的MIC和MBC均为3.27g/L，说明沙门氏菌对槲皮素敏感，槲皮素对沙门氏菌的杀菌效果明显优于杠板归提取物。

3结论与讨论

通过PBD和BBD试验设计优化杠板归中槲皮素的提取工艺，并进行抑菌活性检验，得到最佳提取工艺为：加25倍59.92%乙醇浸泡24h，60℃下回流提取时间3.4h，提取2次。提取物和槲皮素单体对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

在中药有效成分提取中需考虑到多个单因素试验以及试验次数较多的正交设计，工作费时费力且具有盲目性，因此本试验引用PBD设计。PBD是一种近饱和的2水平筛选试验设计方法，通过比较各因子2水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，能用最少的试验次数快速有效地筛选出显著影响因子[24]。BBD具有结果直观、预测性好的优点，试验预测值能更好地考察参数合理性和试验设计的准确性[25]。本研究通过验证试验，其验证结果大于预测值，说明PBD联合BBD设计在中药提取中具有良好的可行性。

本试验在筛选提取因素时药材浸泡24h后槲皮素提取率有所提高，温度对槲皮素提取的影响不明显，温度越高越不利于安全生产，且造成资源浪费，因此在响应面设计中不考虑加热温度的影响。同时，在提取过程发现提取2次可使有效成分完全浸出，故每个平行试验均提取2次。通过检测发现，本研究中供试药材槲皮素的含量仅为0.32mg/g，贵州地区杠板归药材槲皮素的含量0.017～0.495mg/g[26]，说明供试药材的有效成分含量合理。在槲皮素的提取报告中多采用甲醇-酸作为提取液，出于安全考虑，本试验只采用乙醇作为提取液，且结果与甲醇-酸相差不大。杠板归槲皮素的提取优化未有报道，沙芮以艾蒿为原料，得出槲皮素提取需加16倍甲醇[27]，与之相比，本研究只加25倍59.92%乙醇，更节约成本。

在抑菌活性研究中，槲皮素对沙门氏菌的MIC和MBC未超过3.30g/L，但高于滕楠报道的槲皮素对沙门氏菌的最低抑菌浓度2.17g/L[28]。槲皮素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为7.11、3.16g/L，MBC分别为100.18、50.56g/L，与秦晓蓉等的报道[13]相符。杠板归提取物对大肠杆菌的抑菌活性最好，MIC和MBC分别为3.12、12.52g/L，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌MIC和MBC均未超过3.50、26.00g/L。黄学彬等研究得出，75%乙醇、乙酸乙酯和正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌等具有良好的抑菌效果[12]，说明杠板归具有良好的药用价值，值得进一步研究。

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