视网膜色素变性的实验研究进展

蒋鹏飞，彭 俊，欧 晨，姚 震，田 野，王 英，彭清华,

0引言

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种遗传性视网膜病，遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及性连锁隐性遗传等，其特征是双眼发病，慢性进行性视力损害并伴有眼底色素变化[1]。影响全世界约250万人，我国人群发病率约为1/4000，男女比例约3∶2[2]。其特征在于视杆细胞和视锥细胞的逐渐丧失，由此导致严重的视觉功能障碍和双眼最终失明。除了来自约70个基因的超过3 000个基因突变点之外，已经报道了RP与其他类型的视网膜营养不良的广泛遗传重叠[3]。这种遗传病理生理学的多样性使得治疗极具挑战性。虽然已经使用各种药理学试剂(神经营养因子、抗氧化剂和抗凋亡剂)进行了尝试治疗，但大多数并未针对RP的根本原因，并且其临床疗效尚未得到明确证实[4]。目前正在进行或已完成的临床试验中RP的治疗包括基因治疗、细胞治疗和视网膜假体等[5]。眼科学者对视网膜色素变性进行了大量实验研究，取得了一定进展，本文对近年来视网膜色素变性的实验研究进行了综述，并对其未来研究方向进行了展望。

1药物治疗

1.1中药RP的特征在于视杆细胞的死亡，随后是视锥细胞的死亡，逐渐导致部分或完全失明。所有能延缓视网膜感光细胞死亡的药物均能在一定程度上治疗RP。对4、12、24周龄的视网膜色素变性小鼠灌胃中药复方夜明颗粒(由熟地10g，枸杞子10g，黄芪15g，丹参15g，当归10g，制首乌10g，山萸肉10g，灵芝6g，白芍10g，枳壳6g等组成)，给药28d后发现不同周龄的视网膜色素变性小鼠视网膜光感受器细胞层数均多于空白组，组间差异有统计学意义(P<0.05)，说明夜明颗粒能延缓视网膜感光细胞死亡[6]。视网膜色素变性皇家外科学院(Royal College Surgeons，RCS)大鼠是一种较成熟的视网膜退化的动物模型，与人类RP有许多相似之处[7]。对RCS大鼠灌胃中药复方益气明目丸(由党参10g，黄芪15g，白术10g，菟丝子15g，山药10g，茯苓10g，黄精15g，北柴胡10g，葛根10g，丹参15g，当归10g等组成)悬浊溶液，30d后，HE染色观察RCS大鼠视网膜组织结构，免疫组织化学染色法检测各组视网膜组织中Bax、Caspase-3表达，Western Blot法测定各组视网膜组织中Bax、Caspase-3蛋白相对表达水平。结果发现益气明目丸组大鼠视网膜厚度明显较模型组大鼠视网膜增厚，光感受器细胞核数目较模型组多，且益气明目丸组大鼠视网膜组织结构较模型组清晰；益气明目丸组视网膜凋亡因子Bax、Caspase-3平均光密度值均较模型组减少(P<0.01)[8-9]，说明益气明目丸可有效缓解视网膜感光细胞的凋亡，从而对RP起到治疗作用。

夜明颗粒与益气明目丸均含有中药丹参，宋厚盼等[10]基于网络药理学和生物信息学方法分析了丹参治疗RP的分子机制，筛选丹参的入血活性成分和作用靶点，得到与丹参相关的化学成分202个，筛得活性成分65个，其中入血活性成分13个，包括隐丹参酮、木犀草素、丹参酮ⅡA等；得到这些成分可能作用的靶点117个；得到85个丹参影响RP病理过程的特征性基因，这些基因主要涉及转录调控、凋亡信号通路调控、DNA核内复制调节等生物学过程[10-11]。刘家琪等[12]从实验研究方面证实了中药枸杞子-丹参对RCS大鼠视网膜组织结构有改善作用，还可升高αB多肽(alpha B-crystalline，CRYAB)的表达，而CRYAB能抑制凋亡下游基因Caspase-3的激活。

以补肾益精方药液灌胃RCS大鼠，分别于给药7、28d时以TUNEL法检测视网膜感光细胞凋亡情况，与蒸馏水组相比，补肾益精方组视网膜感光细胞凋亡均有所减少(P<0.05)，实时荧光定量PCR显示给药7、28d时补肾益精方组视网膜睫状神经营养因子表达均较蒸馏水组增加(P<0.05)[13]。补肾益精方抑制RCS大鼠感光细胞凋亡的作用可能与神经营养因子的增加有关。

1.2抗氧化剂视网膜感光细胞是除了脑细胞以外氧耗量最多的细胞，随着RP的进展，视杆细胞死亡，聚集在视网膜的氧无法被消耗，引起视网膜细胞氧化损伤[14]。Sulforaphane(SFN)已被证实是治疗许多疾病的有效抗氧化剂，视网膜色素变性小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠分别用SFN和生理盐水处理，检测其视网膜电图及视网膜细胞凋亡情况，与生理盐水组相比，SFN治疗组视网膜电图a波和b波振幅明显增高，视网膜细胞凋亡基因下调，光感受器细胞死亡率降低[15]。表明抗氧化剂SFN对视网膜色素变性有一定的治疗效果。

1.3抗凋亡剂补体激活被认为可抑制视网膜病变中的神经变性[16]，多种补体成分在人与rd10小鼠中光感受器变性时显著上调，C3表达的增加激活了视网膜小胶质细胞，小胶质细胞可清除凋亡光感受器，如果C3缺乏，会减少凋亡光感受器的小胶质细胞吞噬作用并增加对光感受器的神经胶质细胞神经毒性。CR3是C3激活产物iC3b的小胶质细胞表达的受体，增加其表达可有效减少小胶质细胞神经毒性，增加凋亡感光细胞清除率[17]。

1.4神经营养因子3,4-二羟基苯甲酸甲酯(methyl 3,4-dihydroxybenzoate，MDHB)是一种在体外发挥神经保护作用的小分子，有神经营养作用和减少反应性神经胶质增生的能力，可用于治疗视网膜的退行性疾病，而RP存在视网膜感光细胞的退化，在机制上MDHB可以治疗RP。视网膜色素变性rd10小鼠从出生后第12d直到第26d，每天在rd10小鼠腹膜内注射MDHB或等体积的载体。与未处理的动物相比，MDHB处理显著促进视网膜光感受器存活并保持锥体形态；在MDHB处理的rd10小鼠中，视觉行为和ERG反应也大大增强；MDHB还可抑制rd10小鼠视网膜中小胶质细胞激活和Müller细胞胶质增生；使用拮抗剂ANA-12可以阻断MDHB对光感受器存活和结构的保护作用，证明MDHB确实可用于RP的治疗[18]。

殷晓贝等[19]以不同剂量脑源性神经营养因子玻璃体腔注射治疗RP小鼠，发现剂量越高，RP小鼠视网膜抗凋亡蛋白表达越高。证明神经营养因子对RP有治疗作用。在出生10d的RP小鼠玻璃体腔内注射睫状神经营养因子，在14、18、22、30d的视网膜电图a波和b波波幅均高于空白对照组，说明在玻璃体腔内注射睫状神经营养因子能有效延缓RP小鼠视网膜感光细胞的凋亡[20]。

2细胞移植

细胞移植是将细胞引入患者眼内产生健康细胞，以期能够替代无功能的细胞并与剩余的视网膜细胞连接。多能干细胞(pluripotent stem cells，PSCs)，包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，在分子上与功能上都具备与体内的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞相同的分化潜能，相较于PSCs，人类胚胎干细胞(human embroynic stem cells，hESCs)来源的RPE细胞移植更能有效挽救感光细胞[21]。

视网膜色素变性GTP酶调节剂(retinitis pigmentosa GTPase regulator，RPGR)的突变可导致X连锁RP，RPGR定位于连接纤毛的感光器，未突变的RPGR与肌动蛋白的凝溶胶蛋白相互作用并将其激活，凝溶胶蛋白可调节连接纤毛中的肌动蛋白分解，从而促进视紫红质(Rhodopsin，RHo)转运到光感受器外部区域。RPGR的突变扰乱了这种RPGR-凝溶胶蛋白相互作用，损害了凝溶胶蛋白的活化。RPGR和凝溶胶蛋白敲除小鼠均显示光感受器中肌动蛋白聚合和Rho错误定位的异常。使用鼠和人诱导的PSCs模型可恢复光感受器中肌动蛋白的聚合，最终阻止RP的进展[22]。

3基因治疗

基因疗法是一种利用病毒或非病毒载体纠正遗传缺陷的治疗策略，有可能通过替换或沉默致病基因来实现最终治疗，隐性遗传或X连锁突变的RP患者对基因治疗更敏感。对已确定致病基因的RP来讲，基因治疗是目前最有潜力的治疗方式。RP基因治疗的相关研究日益增多，涉及多种RP相关基因。其中，RPE65是恢复视网膜色素上皮中感光细胞功能所必需视觉色素必需酶，目前已鉴定出60多种不同的RPE65基因突变。在遗传性视网膜疾病基因治疗的许多临床试验中，voretigene neparvovec(AAV2-hRPE65v2，Luxturna)的3期临床试验显示对RPE65介导的遗传性视网膜疾病有显著疗效，包括Leber先天性黑矇和RP。Luxturna即将被批准作为第一个眼部基因治疗生物制品[23]。

导致RP的基因突变点较多，近来发现p75NTR基因突变可导致RP，在rd10小鼠中，也发现了p75NTR基因，与WT小鼠相比，在感光细胞死亡峰值之前的早期退化阶段，rd10小鼠视网膜中p75NTR的下游细胞因子proNGF水平增加；在光感受器细胞丧失期间，ProNGF也保持升高。对rd10小鼠单次玻璃体内或结膜下注射p75NTR的拮抗剂THX-B，对视网膜感光细胞有神经保护作用[24]。

在Rho中超过150种不同的突变均可引起RP，Rho突变是常染色体显性遗传RP的最常见原因，常染色体隐性遗传RP多与Rho功能丧失有关。以生长相关蛋白43慢病毒载体转染脂肪间充质干细胞可提高视网膜外核层厚度，提高Rho蛋白表达，对视网膜色素变性具有较好的作用[25]。P23H是Rho基因中最常见的突变位点，CRISPR/Cas9组分可在视网膜P23H基因位点中呈现高速率切割，在WT型小鼠中Rho等位基因中则不切割，这种特异性破坏P23H突变体同时又保留WT功能性等位基因的方式有效地减缓了感光细胞变性。同时，该方法在P23H基因突变的人感光细胞中也成功翻译[26-27]。虽然约45%的突变P23H等位基因在DNA水平上被编辑，但相对RNA表达在P23H突变小鼠中更加灵敏，WT小鼠Rho突变相对RNA表达是P23H突变小鼠Rho相对RNA表达的约2.8倍。利用SpCas9变体和截短RNA间隔介导的等位基因特异性敲除方法，可以实现P23H突变小鼠中相对RNA突变的有效区分，对视网膜感光细胞变性的延迟更加显著[28]。以基因消融联合基因替换治疗的方式破坏内源性Rho基因的表达，治疗后视网膜外核层厚度比单纯AAV注射高17%～36%[29]，基因消融联合基因替换可以治疗由不同Rho突变引起的RP，而不单单针对某一基因突变位点，因此该种治疗方式可用于治疗眼科和其他领域中的多种遗传性疾病。

分离和培养人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，以色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)重组慢病毒转染hUCMSCs，携带PEDF基因的重组慢病毒载体，能高效感染hUCMSCs，感染后的hUCMSCs进行传代培养，慢病毒可延长目的基因在细胞内的表达。将PEDF-hUCMSCs注射到RCS大鼠视网膜下，注射8wk后视网膜外核层厚度高于注射hUCMSCs组[30]，说明基因治疗较单纯细胞移植有更好的治疗作用。

许多X连锁遗传RP动物模型中成功地建立了RPGR的基因替换腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体，RPGR富含嘌呤的区域因含有高度重复的核苷酸序列，其固有序列不稳定，常导致病毒载体克隆过程中出现重组错误，给实验带来较大难度。有研究指出[31]，病毒载体中重组错误出现的主要原因是RPGR蛋白中的谷氨酰化模式与WT变体无法区分。以针对人X连锁遗传RP的AAV8载体是一种优化的基因替代疗法，该载体可一致地产生全长正确的RPGR蛋白，通过AAV8载体递送并由Rho激酶启动子驱动时，密码子优化的RPGR在两种RP动物模型均表现出较好的疗效，并且有良好的安全性，为临床试验提供了治疗基础。在GRK1启动子控制下的RPGR突变体狗中使用密码子优化的人RPGR(hRPGRstb)和RPGR(hRPGRco)两种基因，可抑制狗视网膜感光细胞的退化，从而保持视力[32]。

磷酸二酯酶6-α(phosphodiesterase 6-alpha，PDE6A)基因的突变被广泛认为是人视网膜色素变性的原因，AAV-8的PDE6A在PDE6A突变狗视网膜中有快速的转基因表达，对10只PDE6A突变狗进行视网膜下注射，与未治疗的眼睛相比，治疗眼视网膜感光细胞层厚度得以保留，感光细胞也得以存活[33]，但是也存在一些副作用，如视网膜脱离等。多项研究[34-35]均将人类RP的突变基因在动物RP中进行了基因增强，以往研究的基因突变动物多为小鼠和大鼠，现在越来越多的基因突变动物为大型动物，如犬类等，结果表明基因增强疗法可提高视网膜感光细胞的存活率，降低视网膜感光细胞死亡速度，从而挽救视力。

4展望

眼科学者对RP进行了大量的实验研究，开发出多种RP治疗方法，本文对其进行了一些总结。其中药物治疗与其它治疗方式相比，无侵入性，且方便价廉，如能对药物尤其是中药的作用机制进行更加深入的研究，将有利于研发出效高的新型药物。自体干细胞植入被认为是治疗RP的一种有效方法，但也有报道称自体干细胞移植会引起视网膜前膜及黄斑皱褶[36]，因此干细胞移植的安全性仍需进一步实验研究论证。基因治疗虽然存在一定的局限性，如靶基因过于单一，而导致RP的突变基因较多；给药方式有侵入性，会有患者眼睛带来损伤；临床疗效不确切等。但随着基因编辑技术和新型基因递送载体的发展，基因治疗在未来会成为RP和其他遗传性视网膜疾病最有希望的治疗方式之一，但将实验研究成果运用于临床仍有很长的道路要走。