肿瘤相关自身抗体在肺癌筛查和早期诊断领域的研究进展

杨庭义 常宁 韩志萍 张信信 张勇 张艰

空军军医大学西京医院呼吸与危重症医学科,西安710032

肺癌是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤。降低肺癌病死率,关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗,而早期发现和早期诊断又是最大的关键[1]。当前,肺癌筛查和早期诊断领域还存在许多问题。作为肺癌筛查的主要方法,低剂量CT(low-dose computed tomography,LDCT)较高的假阳性率往往会导致过度的辐射暴露、不必要的有创检查甚至手术等问题[2]。另外,临床常用的肺癌标志物(如CEA、SCC、Cyfra21-1、NSE等)检测和PET-CT检查对早期肺癌的诊断效能较低,在肺癌筛查和早期诊断中的价值不大[3-4]。

基于上述问题,临床亟需特异度高、敏感度好、无创并且方便易行的方法来提高肺癌筛查和早期诊断的效率。近年来的研究发现,包括肺癌在内的多种癌症患者的外周血可检测到肿瘤相关自身抗体[5-7]。而且,在肺癌被诊断前的数月至数年,某些肿瘤相关自身抗体就可在患者的外周血出现,这使其有潜力成为早期肺癌的生物标志物[8-9]。研究显示,欧美地区研发的肺癌相关抗体检测实验(early cancer detection test-lung,EarlyCDT-Lung)能达到90%的特异度和40%的敏感度[10]。我国研发的肺癌7种自身抗体检测实验(7 autoantibodies,7-AAbs)也能达到90%的特异度和61%的敏感度。而且,7-AAbs与LDCT联合显示出良好的互补性[11]。可见,无创的血清抗体检测实验有望成为肺癌筛查和早期诊断的辅助措施。本文将对肿瘤相关自身抗体的产生机制和特点、对肺癌尤其是早期肺癌的诊断效能、在肺癌筛查和早期诊断领域面临的问题等进行综述。

1 肿瘤相关自身抗体的产生机制和特点

1.1 肿瘤相关自身抗体的产生机制 早在20世纪60年代,Baldwin[12]就发现,在一些被致癌物诱导产生肿瘤的小鼠和大鼠体内存在肿瘤特异性抗原,这些抗原可以诱发免疫反应。20世纪70年代,Burnet等[13]提出了免疫监视理论,认为在癌症发生早期,机体的免疫系统通过肿瘤抗原能够识别、抑制或清除癌细胞。21世纪初,Dunn等[14]将免疫监视理论改进为免疫编辑理论,认为免疫系统不仅可以保护机体、避免肿瘤的发生发展,而且通过选择免疫原性低的肿瘤细胞,还可促进肿瘤的进展。Dunn等[15]提出了3种可能的肿瘤细胞结局:一是免疫清除,肿瘤细胞被免疫系统的固有免疫和适应性免疫反应清除；二是免疫平衡,免疫系统已不能清除全部肿瘤细胞；三是免疫逃逸,经过免疫选择的肿瘤细胞以不受控制的方式进展。在这三个阶段尤其在免疫清除阶段,肿瘤抗原不仅可以引起T淋巴细胞反应杀死肿瘤细胞,还可以诱发B淋巴细胞反应产生抗体[16]。

研究发现,在癌症发生早期,肿瘤细胞发生了基因突变、异位或重组等异常变化,这些异常基因表达异常蛋白、异位或过度表达蛋白或蛋白结构异常改变。另外,癌细胞死亡机制也会导致细胞内蛋白的释放。这些蛋白产物能够诱发体液免疫反应产生抗体,即肿瘤相关自身抗体,而这些蛋白产物即成为肿瘤相关自身抗原[16-17]。

1.2 肿瘤相关自身抗体的特点 研究发现,肿瘤相关自身抗体具有以下特点:第一,在癌症发生早期即可在患者的外周血出现。研究显示,在癌症被诊断之前的数月至数年,即癌症尚处于无症状的早期阶段时,就可在患者的外周血检测到某些肿瘤相关自身抗体[8-9]。这意味着,通过检测肿瘤相关抗体,有可能在很早的时期发现癌症；第二,在外周血的滴度较高。在癌症发生早期,外周血的肿瘤相关抗原不仅丰度较低而且易被降解,其细微的异常变化难以被现有技术手段发现,但是其激发免疫系统产生的肿瘤相关抗体被放大了无数倍,这些抗体更容易被现有的技术方法检测到[16-17]；第三,在外周血的稳定性好,半衰期长,血清样本长期保存在-80℃,抗体的理化性质几乎不会改变,这有利于保证抗体检测结果的准确度和稳定性[18-19]。第四,使用常规的酶联免疫吸附实验或酶联免疫分析方法就可进行抗体检测实验,技术简便易行,而且重复性好[18-19]。上述特点意味着,肿瘤相关抗体检测实验有潜力成为肺癌早期诊断的辅助措施。

基于上述特点,国内外研究出多种肺癌相关抗体。由于肿瘤具有异质性,单个抗体对癌症的诊断效能比较低,而多种抗体联合检测则能达到较好的诊断效能。Chapman等[6]的研究显示,在特异度为92%时,1组抗体(p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、GAGE、MUC1、GBU4-5)的敏感度远高于单个抗体(76%比5%～36%),不仅显示出该组抗体对肺癌的良好诊断效能,也证实了1组抗体比单个抗体更具优势。因此,1组抗体联合检测(以下简称抗体谱)成为当前肿瘤相关抗体检测领域的主要方法。

2009年,英国Oncimmune公司研发出肺癌相关抗体谱EarlyCDT-Lung并且逐步在欧美地区进行临床推广[20]。2015年,我国杭州凯宝罗生物科技有限公司研发的七种自身抗体检测试剂盒获得国家食品药品监督管理局的批准,随后得到推广应用。当前,EarlyCDT-Lung和7-AAbs在临床的应用相对较多,逐渐成为肺癌相关抗体检测领域的主流。另外,也有其它多个肺癌相关抗体谱被研究报道,虽未实现临床推广应用,但也显示出相似的诊断效能。

2 抗体谱在肺癌筛查和早期诊断领域的研究进展

2.1 主流抗体谱在肺癌筛查领域的研究进展 在肺癌筛查的临床实践中,EarlyCDT-Lung显示出有益的作用。Healey等[21]的研究发现,对于那些不符合肺癌筛查指南LDCT纳入标准的人群,EarlyCDT-Lung阳性结果可能会使这些人群获得LDCT筛查的依据,从而减少因肺癌高危人群界定不准造成的漏筛。Jett等[22]在美国720个医疗中心对肺癌高危人群(n=1 613)进行了EarlyCDT-Lung检测,随访半年,共诊断出61例肺癌,其中25例肺癌患者的血清呈现抗体阳性,显示EarlyCDT-Lung的敏感度为41%、特异度为87%。而且,在抗体阳性的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中,Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC占比高达57%。此外,研究还发现,抗体阳性者的肺癌发病风险是抗体阴性者的5.4倍。该研究初步证实了EarlyCDT-Lung对肺癌筛查的价值。

英国国家医疗服务体系于2012年开启了一项大规模、前瞻性的随机对照研究,累计纳入研究对象12 209例(50～75岁的肺癌高危人群),随机分入EarlyCDT-Lung实验组、标准临床实践组。EarlyCDT-Lung检测阳性者接受胸部X线和CT扫描,若未发现肺癌证据,则在随后的24个月,每6个月进行1次CT扫描；EarlyCDT-Lung检测阴性者不进行胸部CT扫描。2组研究对象的随访时间均为2年。Sullivan教授[23]在2019年的世界肺癌大会上公布了该研究的初步结果:与标准临床实践相比,在肺癌筛查中联合使用EarlyCDT-Lung与LDCT,可以在4年或更久之前检测出肺癌,降低晚期肺癌在肺癌总体中的占比,并有可能降低全因病死率和肺癌特异性病死率。

2.2 主流抗体谱在早期肺癌诊断领域的研究进展 研究显示,EarlyCDT-Lung对早期肺癌(Ⅰ/Ⅱ期NSCLC)具有较好的诊断效能。Boyle等[20]对EarlyCDT-Lung(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、Annexin I)的诊断效能进行了临床验证,结果显示,EarlyCDT-Lung区分肺癌与对照的特异度为89%～91%、敏感度为36%～39%,其中对早期肺癌的敏感度为30%～36%,初步证实了EarlyCDT-Lung对早期肺癌的诊断价值。Lam等[24]对EarlyCDT-Lung的诊断效能进行了进一步的检验,结果显示,EarlyCDT-Lung区分NSCLC和对照的特异度为84%～89%、敏感度为31%～35%,其中对早期NSCLC的敏感度为28.0%(79/282),再次证实了EarlyCDT-Lung对早期肺癌的诊断意义。而且,Murray等[25]对EarlyCDTLung的技术验证性研究表明,EarlyCDT-Lung具有良好的稳定性、可重复性和准确性。基于这些有利的研究结果,EarlyCDT-Lung在欧美地区实现了临床推广。后来,Chapman等[10]将EarlyCDT-Lung调整为7种抗体谱(p53、NY-ESO-1、CAGE、GBU4-5、SOX2、MAGE-A4、HuD),得到了更优的诊断效能,在特异度为93%时,7种抗体谱对早期肺癌的敏感度在35%～42%。上述研究表明,EarlyCDT-Lung对早期肺癌的诊断具有较好的辅助价值。

在肺结节良恶性的鉴别上,EarlyCDT-Lung也显示出较好的诊断效能。Massion等[26]的研究显示,对于直径在4～20 mm之间的不确定肺结节,EarlyCDT-Lung阳性者发生肺癌的相对风险是抗体阴性者的2.7倍。而且,将EarlyCDT-Lung与基于肺结节影像特征构建的肺癌风险预测模型联合使用,可将特异度提高至92%以上,阳性预测值提高至70%以上,并明显降低假阳性率。Healey等[21]也发现,肺结节患者EarlyCDT-Lung阳性预示着肺癌发病风险升高,EarlyCDT-Lung阳性结果不仅会使临床医师更加仔细地评估患者的胸部CT影像,也会促使患者到肺结节诊疗水平较高的医院就诊,从而减少漏诊和误诊情况的发生。另外,Healey等[21]还发现,EarlyCDT-Lung与CT影像具有互补性,可在高危肺结节的管理中发挥有益的作用。Edelsberg等[27]对EarlyCDT-Lung作为辅助手段鉴别肺结节良恶性进行了成本效用分析,共纳入了1 000例偶然发现且肺癌风险为中危(5%～60%)的肺结节(8～30 mm)患者。结果显示,与单用CT评估肺结节相比,联合使用CT与EarlyCDT-Lung,并且对抗体阳性的肺结节患者直接进行活检,可在更早的分期发现肺癌。虽然EarlyCDT-Lung辅助检出的早期肺癌患者占比偏小,且在一定程度上增加了医疗成本,但是按照现行的质量调整寿命年成本标准,获益依然是划算的。而且,Wang等[28]也认为,由于肺癌相关抗体的特异度很高,因此对于CT筛查阳性并且血清抗体阳性的疑似肺癌患者,应积极进行活检等有创检查,以便及时诊断肺癌。

我 国 的7-AAbs(p53、CAGE、GBU4-5、SOX2、MAGE-A1、PGP9.5、GAGE7)对早期肺癌也显示出较好的诊断效能。Ren等[11]开展的多中心、大样本的临床研究显示,7-AAbs在验证集(肺癌818例、良性对照1 190例)的特异度为90%,在早期NSCLC的敏感度为60%(202/336),明显高于抗原类肿瘤标志物在早期NSCLC的敏感度(CEA为13%、NSE为7%、CYFRA 21-1为25%)。研究还发现,对于肺结节患者,7-AAbs联合LDCT能将LDCT的假阳性率从42.4%降低至9.6%、将LDCT的阳性预测值从57.6%提高至90.4%[11]。该研究表明,7-AAbs对早期肺癌具有较好的诊断效能,对LDCT显示出良好的互补性。后来,Du等[29]对7-AAbs的诊断效能进行了进一步的检验,结果显示,7-AAbs的特异度为91.6%(109/119),在早期NSCLC的敏感度为56.6%(99/175)。即使对于8 mm以下的早期肺癌,7-AAbs的敏感度也能达到56%。此外,研究发现7-AAbs联合LDCT能够将特异度提高至95.8%。该研究进一步证实了7-AAbs对早期肺癌的诊断价值以及对LDCT的良好互补性。He等[30]从不同角度检验了7-AAbs的诊断效能,研究纳入了470例呈现为磨玻璃结节的早期NSCLC和122例良性肺病患者。结果显示,7-AAbs的敏感度和特异度分别为39.6%和90.2%。另外,亚组分析发现,对于非典型腺瘤样增生、原位腺癌和浸润性腺癌,7-AAbs的敏感度分别为22.8%、39.7%、49.4%。可见,7-AAbs对呈现为磨玻璃结节的早期肺癌也有较好的诊断效能。而且,随着肺癌浸润程度的增加,7-AAbs的敏感度也呈现增长的趋势。上述3项研究所用的7-AAbs检测试剂盒以及抗体的截断值相同,报道的特异度(90%～91.6%)也基本一致,但是He等[30]报道的敏感度低于Ren等[11]和Du等[29],可能与纳入的肺癌处于更早的分期有关。

总之,EarlyCDT-Lung和7-AAbs这两个主流抗体谱,对早期肺癌的诊断均显示出较好的效能。而且,抗体谱对LDCT还具有良好的互补价值,二者联合使用能够进一步降低假阳性率,提高特异度和阳性预测值。

2.3 非主流抗体谱在肺癌早期诊断领域的研究进展 除上述的2个主流抗体谱之外,还有其它多个肺癌相关抗体谱也显示出较好的诊断效能。例如,Shan等[31]发现,抗体谱(NY-ESO-1、XAGE-1、ADAM29、MAGEC1)特异度为89%～96%、敏感度为33%～36%。即使在Ⅰ期NSCLC,敏感度也可达到30%(14/47)。Wang等[28]的研究显示,抗体谱(TTC14、BRAF、ACTL6B、MORC2、CTAG1B)区分肺腺癌(n=97,其中Ⅰ+Ⅱ期为75%)与吸烟对照(n=87)的特异度为89%、敏感度为30%；另一个抗体谱(TTC14、BRAF、KLF8、TLK1、KRT8)区分肺腺癌(n=97)与良性肺结节(n=170)的特异度也达到88%,敏感度同样为30%。Lastwika等[32]研究发现,抗体谱(FCGR2A、EPB41L3、LINGO1、S100A7L2)区分恶性肺结节(n=125)与良性肺结节(n=125)的特异度为90%、敏感度为33.3%。上述抗体谱尽管在构成上与EarlyCDT-Lung不同,但均显示出与EarlyCDT-Lung相似的诊断效能。

另外,也有一些研究报道,某些抗体谱具有很高的诊断效能。Li等[33]发现肺癌相关抗体谱(Survivin、Cyclin B1、HCC1、p53)的特异度为100%、敏感度为65%、受试者工作特征曲线下面积为0.908。但值得注意的是,该研究纳入的样本量太少(肺癌60例、正常对照41例),因样本量不达标难以反映抗体谱的实际诊断效能。Wu等[34]的研究显示,由6种噬菌体肽组成的抗体谱区分NSCLC与对照的特异度、敏感度均超过92%。然而,该研究纳入的肺癌患者主要为Ⅲ/Ⅳ期肺癌,但对照组也没有按照吸烟史进行匹配,因此,对这些数据需谨慎解读。类似的研究并不少见,要么样本量偏小,要么纳入的样本多为晚期肺癌,或者研究设计不够严谨,虽然得到了很高的诊断效能指标,但对肺癌筛查和早期诊断的参考价值不大。

2.4 抗体谱对晚期肺癌的诊断价值 尽管多个抗体谱对晚期肺癌(Ⅲ/Ⅳ期NSCLC和小细胞肺癌)均显示出较好的诊断效能,如在特异度为90%时,EarlyCDT-Lung对小细胞肺癌的敏感度约在53%～55%[24,35],对晚期NSCLC的敏感度约在35%～40%[10,20,24],但在临床实践中,晚期肺癌的诊断更需要组织病理学证据。只有在难以获得确切病理结果的情况下,肺癌相关抗体谱或其它肺癌标志物才可能有指导意义。临床上经常遇到高度疑似肺癌的肺肿块患者,1次活检有时得不到确切的病理结果。这种情况下,如果肺癌相关抗体谱或其它肺癌标志物阳性,有助于医师说服患者再次接受活检。事实也证明,多次活检比1次活检得到确切病理诊断的概率更大[18]。

3 抗体谱在肺癌筛查和早期诊断领域面临的问题

在肺癌筛查和早期诊断领域,肺癌相关抗体谱的应用也存在一些问题。一方面,肺癌相关抗体谱存在较高的假阴性率。以EarlyCDT-Lung和7-AAbs为例,尽管其特异度可达到约90%,但它们对早期肺癌的假阴性率也高达40%～60%[36]。如果单独用于肺癌筛查和诊断,必然会造成大量的漏诊。

另一方面,肺癌相关抗体谱可能还存在较高的假阳性率。例如,Trudgen等[37]的研究显示,抗体谱(APEX1、NOLC1、PXN、Bac clone R580E16、MT-RNR2)区分肺癌与对照的敏感度为58%(11/19),但特异度仅有43%(102/237),假阳性率高达57%。因此,他们不支持将抗体谱作为肺癌筛查的主要工具。Zhang等[38]的研究显示,7-AAbs对早期NSCLC的敏感度为65.6%(80/122),但特异度只有57.9%,假阳性率为42.1%。而且,7-AAbs在良性肺结节组(n=49)的阳性率更是高达67.8%。关于肺癌相关抗体谱较高假阳性率的原因,以下2个研究做了初步的探索。Campa等[39]发现,从肿瘤组织分离的B淋巴细胞可产生多反应的单克隆抗体,尽管患者的血清可能对筛选出的抗原呈阳性反应,但可能是多反应的抗体与某些和肿瘤无关的蛋白质起反应的结果,即产生了假阳性。Hoang等[40]也发现,在癌症中发现的体细胞突变也可在正常组织中出现,这些突变产生的新抗原也可在非癌症情况下诱发体液免疫反应,产生的抗体也会导致抗体检测实验假阳性。

上述的假阴性和假阳性问题,不仅意味着肺癌相关抗体谱可能难以区分肺癌与非肺癌,也可能使抗体谱可早于CT发现肺癌的优势失去意义。Campa等[41]的研究显示,所筛选的抗体谱(含25种抗体)不能区分NSCLC(n=125)和良性肺结节(n=125),肺癌相关抗体可能存在生物学局限性。Desmetz等[42]认为,尽管肺癌相关抗体谱显示出可早于CT发现隐匿性肺癌的潜力,但这种优势被其较高的假阴性率所抵消,因此限制了其在肺癌早期诊断领域的应用。Veronesi等[43]也认为,在肺结节发展到能够被CT检出以前,使用肿瘤相关抗体诊断肺癌,给患者造成的长期心理压力可能大于获益,这也会限制其在肺癌筛查领域的应用。

另外,国内的几项研究报道的7-AAbs的特异度也具有较大差异。使用相同的试剂盒以及相同的抗体截断值,Zhang等[38]报道的7-AAbs的特异度只有57.9%,但Ren等[11]、Du等[29]、He等[30]这三项研究却报道了很高的特异度(90%～91.6%)。这可能与对照组的选择或样本量的不同有关,也可能是肺癌相关抗体生物学局限性的反映,值得我们继续探讨和研究。

尽管存在上述问题,但Campa等[41]认为,应该谨慎解读从单一的小样本研究中得出的结论。随着对肿瘤异质性和肿瘤免疫研究的深入,未来有可能找到方法,来解决抗体谱用于癌症筛查和早期诊断准确性受限的问题。

4 展望

在肺癌的筛查和早期诊断领域,肺癌相关抗体谱初步显示出良好的特异度、较好的敏感度以及对LDCT有益的互补作用。但是,当前肺癌相关抗体谱的诊断效能还不够理想,未来仍需要深入地研究肿瘤的异质性和复杂的肿瘤免疫反应,需要筛选出更多与肺癌相关性更好的自身抗体,需要改进抗体检测的技术和方法,以进一步提高其在肺癌筛查和早期诊断领域的应用价值。除了肺癌相关自身抗体之外,循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、DNA甲基化、微小RNA等液体活检技术在肺癌筛查和早期诊断领域也显示出较好的前景。未来,LDCT、肺癌相关抗体检测技术以及其他诊断技术必定会走向优势互补的有机联合,形成更加高效、更加可靠的肺癌筛查和早期诊断模式。

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